重组人白细胞介素-2化学修饰

　　重组人白细胞介素-2的化学修饰

　　重组人白细胞介素-2（Recombinant Human Interleukin-2，rhIL-2）由133个氨基酸组成的单链多肽，有3个半胱氨酸残基，分别位于第58位、105位、125位，第58位和05位半胱氨酸残基形成二硫键。分子量理论值为15420道尔顿，等电点为pH7.7—8.2，比活性大于1.0x107IU/mg蛋白。白细胞介素-2是一种具有多种免疫调节功能的淋巴因子，能激活淋巴细胞杀灭肿瘤等异己细胞，恢复和提高机体的抗病能力。但其在中性溶液中溶解度低、半衰期短、有免疫原性，在临床应用上有一定的局限性。

　　因此，本研究采用聚乙二醇（PEG）化学修饰的方法来克服白细胞介素-2的这些缺点。本研究根据IL-2分子表面的游离氨基（主要为Lys的ε-NH2）具有较高的亲核反应活性，可以与活化的亲水惰性高分子PEG共价结合，而在IL-2分子表面形成一种屏蔽，从而使修饰过的IL-2不易被机体当做异源物质识别，抑制相应的免疫反应，降低血浆清除率，延长半衰期，减少血浆中药物浓度的波动。PEG的生物相容性已经通过美国食品和药品管理局（FDA）的认证，被认为是对蛋白质或多肽类药物进行化学修饰的优选原料。

　　本研究通过对MPEG三聚氯氰和MPEG硝基苯基碳酸盐两种活化PEG修饰rhIL-2进行比较，得出对rhIL-2应该挑选其适当的活化PEG，不同修饰剂对rhIL-2的修饰条件不同。在研究中，还发现MPEG三聚氯氰在反应体系中易水解，但可以通过加入其水解平衡反应底物PEG-4000来抑制其水解，这给用MPEG三聚氯氰修饰其它蛋白质的条件摸索提供了借鉴。

　　经过比较，本研究选用MPEG硝基苯基碳酸盐作为rhIL-2的修饰剂。根据rhIL-2的生物化学特征，以SDS-PAGE电泳，MTT比色法为基本检测系统做为检测手段，较后选定反应时间为1hr，pH 9.3的硼砂溶液，MPEG-NC（MW5000）：rhIL-2为30：1摩尔比为优等反应条件，反应温度为25℃，反应终止剂为冰醋酸。修饰混合物占总蛋白的75％以上。

　　修饰混合物和未修饰的rhIL-2经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水凝胶和Superdex 75 prep grade 凝胶进行分子筛层析，得到的PEG-rhIL-2（MW28000）纯度为90%以上，蛋白收率为23％，比活达到1.54×107。按2000年版《中国生物制品规程》中聚乙二醇残余量检测方法测定游离PEG残留量，符合生物活体实验的要求。

　　我们对PEG-rhIL-2（MW28000）和rhIL-2进行了热稳定性和抗胰酶能力实验，PEG-rhIL-2（MW28000）在25℃和70℃条件下的稳定性均优于rhIL-2，同时PEG-rhIL-2（MW28000）的抗胰酶能力也有明显提高，而且水溶性得到极大增强。