依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡

　　依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡

　　胃癌是常见的恶性肿瘤之一。化疗药物依托泊苷（又名VP16、鬼臼乙叉甙）为细胞周期特异性抗肿瘤药物，依托泊苷可以与DNA拓扑异构酶II相互作用形成药物酶DNA稳定的可逆性复合物，阻碍DNA修复，从而诱导细胞凋亡。BH3only蛋白是近些年来研究比较热门的一类bcl2家族中具有凋亡启动作用的亚家族，包括Bim（bcl2 interacting mediator of cell death），Noxa（PMAIP1），Puma（p53 upregulated modulator of apoptosis），Bad，Bmf等，通过与bcl2/bax相互作用启动“内源性”凋亡途径，引起细胞凋亡。

　　Noxa和PUMA主要受p53调节，细胞DNA损伤后通过p53可以上调Noxa和PUMA的表达； Bim主要结合在微管动力蛋白上，受到细胞因子去除、紫外线照射、微管动摇、Ca2+流出和紫杉醇等刺激后可以转移到线粒体膜上［2］，从而发挥促凋亡活性。本研究使用依托泊苷作用胃腺癌细胞，检测BH3only蛋白的表达与细胞凋亡之间的关系，研究依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡的分子机制。

　　1  材料和方法   

　　1.1  材料   

　　依托泊苷购自沈阳科瑞斯德医药科技有限公司；SGC7901和BGC823胃腺癌细胞购自上海生命科学院细胞库，Annexin V 为caltag公司产品；TRIzol为Invitrogen公司产品；逆转录试剂盒为Promega公司产品；引物由上海生工生物工程公司合成。

　　1.2  主要实验仪器   

　　流式细胞仪型号为FACScalibur；PCR仪为MJ RESEARCH .INC公司的PTC100；凝胶成像系统为黑马公司产品；电泳仪为北京六一仪器厂产品。

　　1.3  细胞培养及药物配制   

　　SGC7901和BGC823细胞接种于含有10%小牛血清（FCS）、1%双抗、1%L谷胺酰胺的DEME培养液中，在37℃，CO2浓度为5%的培养箱中生长，每2～3d传代一次。依托泊苷用DMEM培养液配制成10 000��M储存液，在－20℃中保存，临用前稀释成所需浓度。

　　1.4  流式细胞术   

　　用酶消化法收集不同浓度依托泊苷诱导各个时点的细胞，冰冷PBS洗涤两遍，binding buffer重悬细胞，调整细胞密度为5�105/ml，取195��l细胞悬液加5��l Annexin V混匀避光作用30min。流式细胞仪在488nm激发波长处进行检测，实验重复3次，取平均值，结果用WINMDI2.8软件分析。

　　1.5  RNA提取及质量鉴定   

　　按TRIzol说明提取细胞总RNA，紫外分光光度计鉴定样品的纯度和浓度。测得的A260/A280均在1.8～2.0之间，RNA电泳可见清晰的28S、18S和5S三条带，RNA用PCR扩增GAPDH无产物，表明所提取的RNA中没有DNA污染。

　　1.6  半定量RT

　　PCR    逆转录依照Promega逆转录试剂盒说明操作，各个标本调整到同一浓度再进行逆转录。内参照为GAPDH，引物：GAPDH（580bp）上游：AATCCCATCACCA TCTTCCA，下游：CCTGCTTCACCACCTTCTTG，Noxa（196），上游：AGATGC CTGGGAAGAAG，下游：AGTCCCCTCATGCAAGT，Bim（204bp），上游：GCCCCT ACCTCCCTACAGAC，下游：ATGGTGGTGGCCATACAAAT，Puma（212bp），上游：GCCCAGACTGTGAATCCTGT，下游：TCCTCCCTCTTCCGAGATTT，PCR的反应程序为：94℃ 5min后进入循环，每循环为94℃ 30s，55℃ 30s 72℃ 30s，32个循环，较后是72℃延伸7min ，内参照GAPDH的引物在第8个循环后加入，扩增24个循环。取8��l PCR反应产物，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，80V，1h，在黑马凝胶成像系统拍照。以GAPDH的表达强度为对照观察Noxa、Bim和Puma的相对表达强度。

　　2  结果   

　　2.1  依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡   

　　我们用50��M、100��M、250��M和400��M四个浓度的依托泊苷作用SGC7901细胞48h，然后用FITCAnnexin V染色流式细胞仪检测凋亡细胞。结果显示随着依托泊苷浓度的增加，细胞的凋亡率不断增加，见图1a，半数抑制浓度IC50为100��M。然后我们用100��M的依托泊苷作用SGC7901细胞8h、16h、24h、36h和48h，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，结果显示依托泊苷作用8h即有细胞发生凋亡，随着时间的增加，凋亡也不断增加，48h达到50%。

　　由此我们可以得出依托泊苷诱导SGC7901胃腺癌细胞凋亡具有剂量和时间依赖性。然后我们用100��M的依托泊苷作用BGC823胃腺癌细胞48h，流式细胞仪检测凋亡率为20%，与SGC7901的结果比较，我们得出SGC7901为依托泊苷敏感细胞株，而BGC823为不敏感细胞株。 流式细胞仪检测细胞凋亡结果见图2。

　　2.2  依托泊苷能上调敏感细胞株SGC

　　7901中Noxa mRNA表达    在SGC7901和BGC823细胞株中Bim的mRNA表达都上调。

　　将100��M的依托泊苷分别作用SGC7901和BGC823胃腺癌细胞0h、4h、8h、16h和24h，然后检测Noxa、Bim和PUMA的mRNA表达水平。结果显示在SGC7901细胞中，Noxa的mRNA表达早在4h即开始明显增加，8h达到高峰，见图3a。在BGC823细胞中，Noxa的mRNA表达无明显变化。

　　Bim的mRNA在两个细胞系中均表达上调，不过开始升高的时间靠后，在SGC7901中8h开始升高，见图3c，在BGC823中16h开始升高，见图3d，而且升高的幅度没有Noxa的mRNA大。两个细胞系在依托泊苷诱导后PUMA的mRNA表达没有变化（结果尚未发表）。