肿瘤耐药和其发生机制

　　一、什么是肿瘤耐药？肿瘤耐药概述

　　目前，许多肿瘤常规化疗效果差，预后不良是困扰临床的重要难题，而肿瘤多药耐药性（MDR）则是肿瘤化疗失败的关键因素。经治疗后。残存的肿瘤干细胞耐药性形成，常导致对某些药物治疗敏感性降低，并引起肿瘤复发甚至转移，因此MDR已成为当今医学界研究的热点。

　　人恶性肿瘤对化疗的耐药性可分为先天性耐药（nature resistance ）和获得性耐药（acquired resistance）；根据耐药谱又分为原药耐药（primary drug resistance ，PDR）和多药耐药（multidrug resistance ， MDR）。PDR只对诱导的原药产生耐药，面对其它药物不产生产交叉耐药；MDR是由一种药物诱发，但同时又对其它多种结构和作用机制迥异的抗癌药物产生交叉耐药。人们为更好地了解肿瘤耐药对化疗患者的潜在影响，而对MDR的发生机制、检测手段及逆转耐药等方面进行了广泛深入研究，取得很大进展。

　　二、耐药发生的机制

　　1、DNA修复能力的增强与耐药的关系

　　DNA是传统的化疗药品烷化剂和铂类化合物的作用靶点，这些药物的细胞毒性与DNA损伤有关。DNA损伤的一个修复机制是切除修复，切除修复需核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等的参与。化疗药致使DNA损伤，当二氢叶酸还原酶（DHFR）和DNA损伤修复相关酶活性增强（MGMT）可增加其对化疗药的耐药程度。

　　阿非迪霉素（aphidicolin）是DNA多聚酶α和γ亚基的抑制剂。

　　2、P-糖蛋白与多药耐药

　　目前研究较多的是多药耐药，与多药耐药有关的分子是P-糖蛋白。1976年，Juliano等首先在耐药有中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中发现一种分子量约为1.7×105的膜糖蛋白，在敏感细胞中却不存在。以后，研究者陆续在不同来源的多药耐药细胞中发现这种糖蛋白，其分子量在1.3×105~1.8×105之间，主要集中在1.5×105~1.8×105之间。并发现该糖蛋的表达和细胞膜的通透性、细胞内药物浓度以及细胞耐药程度有关。定位于7号染色体的q21.1带上的MDR1基因。完整的P-gp分子共有12个跨膜疏水区和2个ATP结合位点，在膜内以二聚体或四聚体方式存在。

　　P糖蛋白是一种能量依赖性药物排出泵，也就是说它可以与一些抗肿瘤药物结合，也有ATP结合位点。P-糖蛋白一旦与抗肿瘤药物结合，通过ATP提供能量，就可将药物从细胞内泵出细胞外，使药物在细胞内浓度不断下降，并使其细胞毒作用减弱直至散失，出现耐药现象。

　　P-gp在正常胆管、肾、小肠、肾上腺、造血干细胞等均有表达，负责激素运输及排泌毒物等生理功能。P-gp高表达的肿瘤病人常伴预后不良，如低缓解率、高复发率、生存期短，可作为预后评价指标。

　　钙拮抗剂（或钙调蛋白拮抗剂）如维拉帕米、异博定、尼卡地平可使耐药细胞部分恢复对化疗药物的敏感性，其中以维拉帕米的作用较明显。维拉帕米对耐药细胞的作用不是通过调节钙浓度，而是与抗癌药物竞争P-糖蛋白的结合位点。但是钙拮抗剂在逆转耐药的剂量下还具有一些副作用，使这类药物临床应用受到限制。

　　钙调蛋白（CAM）抑制剂：改变膜电位，使耐药细胞膜电位恢复至敏感细胞水平，从而恢复其敏感性。如钙调蛋白拮抗剂三氟拉嗪的作用。

　　亲脂性化合物：环孢菌素类（环孢菌素A及其衍生物SDZPSC833）。

　　激素及抗激素类化合物：（TAM）及抗孕激素药RU486 ，孕酮、甲地孕酮。

　　下一页：谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）与肿瘤耐药性、蛋白激酶C（PKC）

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 　　3、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）与肿瘤耐药性

　　GSTs是一种广泛分布的二聚酶，它可以单独或与谷胱甘肽一起参与许多环境毒素的代谢、解毒。根据其在细胞内定位的不同，一般可分为α、μ、π、θ及膜结合微粒体5种类型 。GST-π又称酸性同工酶，是从胎盘中分离出来的一种酸性GST，其基因定位于11号染色体的q13位置。有7个外显子和6个内含子，全长3kb。它与恶性肿瘤关系较密切，约占其总数的90％，主要分布于消化道、泌尿系统和呼吸道上皮。

　　GSH是一种含半胱氨酸的三肽，为细胞内主要的非蛋白巯基。GSTs能够催化机体内亲电性化合物与GSH结合，使有毒化合物增加水溶性、减少毒性，较终排出细胞外。这种结合还可防止有毒化合物与细胞的大分子物质（如DNA、RNA和蛋白质）结合。正常情况下可作为一种保护机制使细胞免受损害，而肿瘤细胞可以通过调节GSH水平、增加GST活性等加速化学药物的代谢。

　　针对谷胱甘肽和GST的逆转剂：目前抑制GSH的药物有丁硫氨酸亚砜胺（buthionine sulfoximine ，BSO）、硝基咪唑类、VitK3、扑热息痛、硒酸钠、硒半胱氨酸、GS-EA等。BSO是一种人工合成的氨基酸，它是GSH合成限速酶－γ谷氨酰-半胱氨酸合成酶的效果很强抑制剂，能有效地阻断GSH的合成，从而降低细胞内GSH水平，并增加肿瘤细胞对Mit、DDP和MMC的敏感性。利尿酸，其可逆转烷化剂的耐药，且有实验证实与BSO联用时逆转作用更大。此外，还有依他尼酸（ethacrynic acid）等。

　　4、拓扑异构酶Ⅱ

　　拓扑异构酶是DNA复制时必需的酶，它在染色体解旋时催化DNA断裂和重新连接，拓扑异构酶是许多DNA插入和非插入药物作用的靶点，拓扑异构酶Ⅱ在数量和功能上的改变可能是产生细胞耐药的机制。

　　5、蛋白激酶C（PKC）

　　PKC是一组Ca2+/磷脂依赖的同工酶，由两个不同的功能部位组成，即与磷脂、甘油二酯结合的疏水性调节部位，以及含有ATP的底物蛋白结合区域，后者是亲水性催化部位。PKC有12种类型，各亚型具有不同的组织表达和特定的细胞定位，其中，PKCα和PKCθ与肿瘤多药耐药的关系较为密切。PKC在机体细胞增值、分化和凋亡信号传导调控方面发挥重要作用，同时在肿瘤发生、发展及对抗瘤因子的反应方面也扮演着重要角色。PKC参与蛋白质的磷酸化过程，而p-gp是一种磷酸化蛋白，MDR细胞中PKC活性增高，说明两者存在一定的联系。

　　根据作用于PKC的部位，其抑制剂可分为3类：①作用于催化区；②作用于调节区；③对以上两区均有作用。目前已证实的逆转剂有Staurosporine及其衍生物NA-382、CGP41251；此外还有K-252a、calphostinC、H-7等药物。

　　6、多药耐药相关蛋白（multidrug related protein，MRP）

　　1992年新发现的MRP属ABC转运蛋白超家族成员，MRP基因定位于16号染色体p13.1带上，由6500bp组成，编码1531个氨基酸的跨膜糖蛋白，分子量为190kD。MRP至少有四种亚型，已知MRP1增高是引起MDR的主要原因之一。耐药的发生与依赖ATP的谷胱甘肽S结合载体（glutathione-S-conjugate carrier）活性提高的缘故，谷胱甘肽S结合的输出载体又称为“GS-X泵”，它可将阴离子的共轭物排泄出细胞，并在清除外源性毒素中发挥作用。

　　MRP能介导药物中的谷胱甘肽硫共轭物、葡萄糖醛酸甙共轭物和硫酸盐共轭物排出细胞。MRP转运的步骤可能为：GSH合成→GSH与药物偶和→MRP将药物泵出细胞外。MRP不但定位于血浆细胞膜，而且存在于内质网、高尔基滤泡处，提示MRP还可在细胞内隔离药物，使药物不能与靶位点结合，从而间接导致耐药。

　　喹啉类、抗激素类（如抗孕激素RU486）、非甾体抗炎药（NASID）、SN-38、GST耗竭剂都能逆转MRP介导的MDR。

　　多药耐药相关蛋白增高可引起ADR、表阿霉素、鬼白乙叉苷（VP-l6）、长春花碱（Vinblastine）、长春新碱（VCR）、放线菌素D、秋水仙素等耐药。

　　下一页：肺耐药蛋白（LRP）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）

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　　7、肺耐药蛋白（LRP）

　　肺耐药蛋白是1993年由Scheper等在1株无p-gp表达的对多种药物耐药的非小细胞肺癌细胞系SW-1573中很早发现的与多药耐药有关的蛋白称LRP。LRP基因定位于16号染色体，LRP的cDNA全长2688bp，编码896个氨基酸，分子量为110kD，为一种穹隆蛋白（vault protein），现发现它广泛分布于正常组织细胞，主要位于胞浆，呈粗颗粒状或囊泡状。MVP可通过两种途径引起MDR：一是封锁核孔，使药物不能进入细胞核，二是使进入细胞内的药物转运至胞质中的运输囊泡，呈房室分布，较终经胞吐机制排出。

　　LRP可随介导顺铂、卡铂、烷化剂等一些P-gp和MRP不能介导的药物从核到胞浆重新分布而产生耐药。已知上述药物均以DNA为靶点，故LRP的高表达可能主要通过核靶点屏蔽机制引起MDR出现。此外，还与细胞毒性/抑制性化疗药物被包裹在隔离微囊内而不能发挥作用有关。

　　8、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）

　　BCRP定位于染色体4q22，含有一个开放读框（ORF），编码一个633氨基酸的蛋白，至少与50个ATP结合盒（adenosine triphosphate -binding cassette，ABC）膜转运蛋白具有同源性。BCRP结构的较主要特点是只有一个ATP结合结构域和一个疏水性的跨膜结构域，这与典型的ABC转运蛋白明显不同，后者往往由两个同源部分组成，每个部分含有一个ATP结合结构域和一个疏水性的跨膜结构域。因此，称BCRP为半转运蛋白，推测可能本身或与其它转运分子形成二聚体或多聚体而发挥作用。

　　9、细胞凋亡与耐药

　　p53、bcl-2和c-myc发生缺失、突变等导致表达异常（突变型）时，对凋亡过程调控异常，可抑制化疗药物诱导的凋亡，导致耐药，同时也可特异性激活MRP-1／P-gp，产生MDR。c-myc基因很可能参与了mdr1基因的调控。半胱氨酸蛋白水解酶和耐药：天门冬氨酸半胱氨酸特异性蛋白酶家族即caspase家族，亦称ICE/CED-3家族，是一组与细胞凋亡有关的蛋白酶，也参与MDR。Topo I和Topo II可作为caspase 3和6作用底物。化疗药物引起细胞凋亡均须激活caspase。

　　加入促凋亡物质如全反式维甲酸等可降低耐药细胞BCL-2、BCL-XL等基因的表达。植入促凋亡基因，如野生型p-53基因等。

　　10、其它

　　细胞膜的改变影响药物的转运和外排；细胞激素受体量和亲和力的改变；一些细胞因子（如IL-6 [42]）等也与肿瘤细胞耐药的发生相关。