脑胶质瘤分子个性化治疗
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时间：2016/10/20 20:33
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脑胶质瘤是较常见的原发性脑肿瘤，其中一半以上为恶性度很高的胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）。GBM 病人即便采用了较为积极的治疗手段，中位生存期依然少于 15 个月。近些年，神经肿瘤分子病理取得了重大进展，目前已发现一系列有助于脑胶质瘤临床诊断和预后判断的分子标志物。
目前的 WHO 病理分级依然依赖形态学进行肿瘤分级，可是，有充分的证据表明，组织特征相似或相同的胶质瘤可以具有不同的分子遗传学背景，引起 WHO 分级相同的个体间预后有着较大差别。
基于肿瘤遗传学水平的分子病理分型可以更准确地判断临床预后；并且对组织学上较难鉴别的混合性胶质瘤（少突星形细胞瘤和间变性少突星形细胞瘤）还能帮助明确诊断和分级。除此以外，这些新近发现的分子变异有可能成为未来治疗的新靶点。近 10 年来，尽管脑胶质瘤的基础和临床研究有了较大突破，然而弥漫性胶质瘤病人预后的改善依然十分缓慢。
进一步了解胶质瘤的分子生物学特征，通过临床试验明确更多潜在的分子标志物，有望揭开脑胶质瘤病理生理和发病机制的神秘面纱。除了种族、生活习惯、年龄和性别等临床常见因素，重要的分子标志物的筛选，对临床应用均有深远的意义。
现有的胶质瘤分类系统胶质瘤是指来源于胶质细胞的肿瘤，本指南中特指来源于星形胶质细胞或少突胶质细胞的肿瘤。根据肿瘤生长方式，胶质瘤可以分为两类：局限性胶质瘤（毛细胞型星形细胞瘤）与弥漫性胶质瘤。
根据 WHO 中枢神经系统肿瘤分类（2007 年，第四版），弥漫性胶质瘤可以分为Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级。病理特征：弥漫性星形细胞瘤（WHOⅡ级）具有大量增生的胶质纤维，伴有轻中度核异型和明显活跃的核分裂象。
少突胶质细胞瘤（WHOⅡ级）表现为细胞边界清楚、细胞浆透明，有位于细胞中央的圆形细胞核，呈蜂巢样排列。间变性少突胶质细胞瘤（WHOⅢ级）表现为明显的细胞核异型性和血管增生。
CBM（多形性胶质母细胞瘤，WHOⅣ级），作为较有侵袭性的胶质瘤，表现为有瘤组织内细胞丰富，瘤细胞大，明显核异型，核分裂多见，血管内皮细胞增生，可见大量的不成熟血管，可合并大片出血和坏死。
原发的 GBM 多发生于 55 岁以上的中老年病人，而继发的 GBM 多发生于年龄小于 55 岁病人中，是由低级别胶质瘤发展而来，占 CBM 的 5.0% -10%。WHOⅡ级和 WHOⅢ级胶质瘤发展成 GBM 的时间平均为 5 年和 2 年。在分子病理水平上，原发 GBM（5.0%） 的 IDH 突变明显低于继发 GBM（84.6%）。
当前的治疗方法目前治疗指南建议对胶质瘤采用手术和（或）放疗和（或）化疗的综合治疗方式。手术 很大程度安全切除肿瘤；放疗 分次外照射；化疗 替莫唑胺（TMZ）化疗。替莫唑胺是相对耐受良好的口服烷化药剂，易通过血脑屏障，在细胞内转化为效果很强的烷化剂，使鸟嘌呤烷基化，损伤 DNA，引起瘤细胞死亡。现有的标准治疗还未达到个体化治疗的水平。
（一）IDH 突变
实验室检测方法：在基因水平，可采用焦磷酸测序；在蛋白质水平，可采用免疫组织化学法。 使用焦磷酸测序。
建议：在各级别胶质瘤中，相对于 IDH 野生型，IDH 突变型的病人预后较好。IDH 突变状态可辅助诊断胶质瘤。
（二）MGMT 启动子甲基化
实验室检测方法：焦磷酸测序或甲基化特异性 PCR 是评估 MGMT 启动子甲基化状态的优等选择。用免疫组织化学检测 MGMT 蛋白表达从而推测 MGMT 启动子区甲基化状态并不可靠。 焦磷酸测序的方法。
建议：MGMT 启动子甲基化提示 GBM 病人预后较好。对于年龄 >70 岁的老年病人，假使有 MGMT 启动子甲基化，放疗联合辅助化疗或单纯化疗可以延长生存期，改善生活质量；无 MGMT 启动子甲基化的老年病人不建议辅助化疗。
（三）染色体 lp/19q 缺失
实验室检测方法：实验室检测 lp/19q 状态的方法包括荧光原位杂交、基于杂合性缺失分析的聚合酶链式反应 （PCR） 和阵列比较基因组杂交（CGH）。 采用荧光原位杂交技术。
建议：对于有 lp/19q 联合缺失的少突或间变性少突胶质细胞瘤病人， 化疗或联合放化疗。
（四）EGFR 扩增和 EGFRvⅢ重排实验室检测方法：EGFR 扩增：荧光原位杂交；EGFRvⅢ重排：实时定量 PCR，免疫组织化学，多重探针依赖式扩增技术。 使用荧光原位杂交检测 EGFR 重排。
建议：有 EGFR 扩增的大于 60 岁的 GBM 病人预后差，诊断方面的意义表现在两方面：对小细胞 GBM 的诊断；辅助判定活检组织的病理结果。
（五）PTEN 基因突变
实验室检测方法：对外显子区域进行 PCR，Sanger 测序检测 PTEN 突变。
建议：建议对 WHOⅢ级和Ⅳ级的胶质瘤样本检测 PTEN 的突变。有 PTEN 突变的间变性星形细胞瘤病人预后较差。
（六）TP53 基因突变
实验室检测方法：对外显子区域进行 PCR，Sanger 测序检测 TP53 突变。
建议：TP53 突变在低级别星形细胞瘤和继发 GBM 中发生率高。有 TP53 突变的低级别胶质瘤预后较差。
（七）BRAF 融合和点突变
实验室检测方法：KIAA1549-BRAF 基因融合：荧光原位杂交，实时定量PCR；BRAFVa1600Glu 突变：免疫组织化学，焦磷酸测序。
建议：KIAA1549-BRAF 融合基因和 BRAF Va1600Glu 突变与毛细胞型星形细胞瘤密切相关，具有非常强的诊断价值；是靶向治疗的标志物。
（八）Ki-67
实验室检测方法：免疫组织化学。
建议：对于低级别弥漫性胶质瘤是一个预测预后的可靠指标（九）miR-18ld
实验室检测方法：原位杂交。
建议：miR-18ld 对于 GBM 是一个预测预后的可靠指标。临床检测 miR-18ld 的表达水平能提示 GBM 病人对 TMZ 化疗的敏感性。
胶质瘤分子诊断的质控
分子遗传学和分子生物学的技术进展，将胶质瘤的诊治水准提升到了分子水平，同时也对肿瘤样本的质量提出了更高的要求。因而，肿瘤样本的质量控制是包括胶质瘤在内的所有肿瘤临床样本分子诊断过程中的基本环节。根据胶质瘤术程长、异质性高、易复发等特点，在进行分子诊断检测之前，应当从以下几个方面进行质控。
1.标准操作程序 （standard operation procedure，SOP） 和临床实践指南 （clinical practice guideline，CPG）。一旦胶质瘤样本离开病人身体后，由于缺乏必须的生存环境，必然发生组织降解，使其内部的生物分子发生降解，引起生物信息改变、甚至丢失，从而降低样本的可利用价值。样本降解的速度与不少因素（pre-analytical variables） 有关，需要检测的目的生物分子对致降解因素的易感性也各不相同。
因此，严格执行 SOP 与 CPG，在分子诊断中将人为影响和环境因素的作用降到很低，才能很大限度地维持所检分子的完整性，确保胶质瘤分子诊断的准确性。
2.个体化分析：肿瘤细胞组成、需要指出的是病人自身体质和肿瘤血运分布等个体因素可以对单个胶质瘤标本的降解速度的影响不尽相同；因而，在临床操作中，应当对每例病人样本的取材方法、保存运输条件、冷冻时间等诸多分子诊断前数据做个体化分析。
对各例样本进行降解程度评估，用以校正分子诊断结果。对经历放、化疗的病人，做分子诊断时应当考虑放、化疗等因素对所检分子的影响，并区别放化疗因素造成胶质瘤的继发性分子变化。
3. 的精细化的分子诊断：首先，考虑到胶质瘤的异质性，不宜将整块肿瘤组织一同匀浆进行分子分析；而应当对每例待检样本进行病理切片和组织学观察。根据组织形态学特点，必要时应当在显微镜下（石蜡切片）或冰冻切片机上（冰冻切片）对细胞进行选择性收集 （selective tissuedissection）。
4.本版本提出的胶质瘤分子诊断指南是在基因水平（包括 DNA、mRNA 和 miRNA）所做的定性分析，无法获知具有基因分子特征的细胞在所检胶质瘤组织中的比例和分布情况，因此在根据这些基因特征选择治疗方案和预后分析时可能出现偏差。
为了提高胶质瘤分子诊断水准、较终实现精确精准治疗的目的，适时研发并优化以 RNA、蛋白质为标准的定量分子诊断手段，条件允许的时候利用诸如靶向蛋白定量质谱之类的先进技术手段对胶质瘤进行量化的分子诊断，是胶质瘤分子诊断的较终目标与方向。
目前的 WHO 病理分级依然依赖形态学进行肿瘤分级，可是，有充分的证据表明，组织特征相似或相同的胶质瘤可以具有不同的分子遗传学背景，引起 WHO 分级相同的个体间预后有着较大差别。
基于肿瘤遗传学水平的分子病理分型可以更准确地判断临床预后；并且对组织学上较难鉴别的混合性胶质瘤（少突星形细胞瘤和间变性少突星形细胞瘤）还能帮助明确诊断和分级。除此以外，这些新近发现的分子变异有可能成为未来治疗的新靶点。近 10 年来，尽管脑胶质瘤的基础和临床研究有了较大突破，然而弥漫性胶质瘤病人预后的改善依然十分缓慢。
进一步了解胶质瘤的分子生物学特征，通过临床试验明确更多潜在的分子标志物，有望揭开脑胶质瘤病理生理和发病机制的神秘面纱。除了种族、生活习惯、年龄和性别等临床常见因素，重要的分子标志物的筛选，对临床应用均有深远的意义。
现有的胶质瘤分类系统胶质瘤是指来源于胶质细胞的肿瘤，本指南中特指来源于星形胶质细胞或少突胶质细胞的肿瘤。根据肿瘤生长方式，胶质瘤可以分为两类：局限性胶质瘤（毛细胞型星形细胞瘤）与弥漫性胶质瘤。
根据 WHO 中枢神经系统肿瘤分类（2007 年，第四版），弥漫性胶质瘤可以分为Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级。病理特征：弥漫性星形细胞瘤（WHOⅡ级）具有大量增生的胶质纤维，伴有轻中度核异型和明显活跃的核分裂象。
少突胶质细胞瘤（WHOⅡ级）表现为细胞边界清楚、细胞浆透明，有位于细胞中央的圆形细胞核，呈蜂巢样排列。间变性少突胶质细胞瘤（WHOⅢ级）表现为明显的细胞核异型性和血管增生。
CBM（多形性胶质母细胞瘤，WHOⅣ级），作为较有侵袭性的胶质瘤，表现为有瘤组织内细胞丰富，瘤细胞大，明显核异型，核分裂多见，血管内皮细胞增生，可见大量的不成熟血管，可合并大片出血和坏死。
原发的 GBM 多发生于 55 岁以上的中老年病人，而继发的 GBM 多发生于年龄小于 55 岁病人中，是由低级别胶质瘤发展而来，占 CBM 的 5.0% -10%。WHOⅡ级和 WHOⅢ级胶质瘤发展成 GBM 的时间平均为 5 年和 2 年。在分子病理水平上，原发 GBM（5.0%） 的 IDH 突变明显低于继发 GBM（84.6%）。
当前的治疗方法目前治疗指南建议对胶质瘤采用手术和（或）放疗和（或）化疗的综合治疗方式。手术 很大程度安全切除肿瘤；放疗 分次外照射；化疗 替莫唑胺（TMZ）化疗。替莫唑胺是相对耐受良好的口服烷化药剂，易通过血脑屏障，在细胞内转化为效果很强的烷化剂，使鸟嘌呤烷基化，损伤 DNA，引起瘤细胞死亡。现有的标准治疗还未达到个体化治疗的水平。
（一）IDH 突变
实验室检测方法：在基因水平，可采用焦磷酸测序；在蛋白质水平，可采用免疫组织化学法。 使用焦磷酸测序。
建议：在各级别胶质瘤中，相对于 IDH 野生型，IDH 突变型的病人预后较好。IDH 突变状态可辅助诊断胶质瘤。
（二）MGMT 启动子甲基化
实验室检测方法：焦磷酸测序或甲基化特异性 PCR 是评估 MGMT 启动子甲基化状态的优等选择。用免疫组织化学检测 MGMT 蛋白表达从而推测 MGMT 启动子区甲基化状态并不可靠。 焦磷酸测序的方法。
建议：MGMT 启动子甲基化提示 GBM 病人预后较好。对于年龄 >70 岁的老年病人，假使有 MGMT 启动子甲基化，放疗联合辅助化疗或单纯化疗可以延长生存期，改善生活质量；无 MGMT 启动子甲基化的老年病人不建议辅助化疗。
（三）染色体 lp/19q 缺失
实验室检测方法：实验室检测 lp/19q 状态的方法包括荧光原位杂交、基于杂合性缺失分析的聚合酶链式反应 （PCR） 和阵列比较基因组杂交（CGH）。 采用荧光原位杂交技术。
建议：对于有 lp/19q 联合缺失的少突或间变性少突胶质细胞瘤病人， 化疗或联合放化疗。
（四）EGFR 扩增和 EGFRvⅢ重排实验室检测方法：EGFR 扩增：荧光原位杂交；EGFRvⅢ重排：实时定量 PCR，免疫组织化学，多重探针依赖式扩增技术。 使用荧光原位杂交检测 EGFR 重排。
建议：有 EGFR 扩增的大于 60 岁的 GBM 病人预后差，诊断方面的意义表现在两方面：对小细胞 GBM 的诊断；辅助判定活检组织的病理结果。
（五）PTEN 基因突变
实验室检测方法：对外显子区域进行 PCR，Sanger 测序检测 PTEN 突变。
建议：建议对 WHOⅢ级和Ⅳ级的胶质瘤样本检测 PTEN 的突变。有 PTEN 突变的间变性星形细胞瘤病人预后较差。
（六）TP53 基因突变
实验室检测方法：对外显子区域进行 PCR，Sanger 测序检测 TP53 突变。
建议：TP53 突变在低级别星形细胞瘤和继发 GBM 中发生率高。有 TP53 突变的低级别胶质瘤预后较差。
（七）BRAF 融合和点突变
实验室检测方法：KIAA1549-BRAF 基因融合：荧光原位杂交，实时定量PCR；BRAFVa1600Glu 突变：免疫组织化学，焦磷酸测序。
建议：KIAA1549-BRAF 融合基因和 BRAF Va1600Glu 突变与毛细胞型星形细胞瘤密切相关，具有非常强的诊断价值；是靶向治疗的标志物。
（八）Ki-67
实验室检测方法：免疫组织化学。
建议：对于低级别弥漫性胶质瘤是一个预测预后的可靠指标（九）miR-18ld
实验室检测方法：原位杂交。
建议：miR-18ld 对于 GBM 是一个预测预后的可靠指标。临床检测 miR-18ld 的表达水平能提示 GBM 病人对 TMZ 化疗的敏感性。
胶质瘤分子诊断的质控
分子遗传学和分子生物学的技术进展，将胶质瘤的诊治水准提升到了分子水平，同时也对肿瘤样本的质量提出了更高的要求。因而，肿瘤样本的质量控制是包括胶质瘤在内的所有肿瘤临床样本分子诊断过程中的基本环节。根据胶质瘤术程长、异质性高、易复发等特点，在进行分子诊断检测之前，应当从以下几个方面进行质控。
1.标准操作程序 （standard operation procedure，SOP） 和临床实践指南 （clinical practice guideline，CPG）。一旦胶质瘤样本离开病人身体后，由于缺乏必须的生存环境，必然发生组织降解，使其内部的生物分子发生降解，引起生物信息改变、甚至丢失，从而降低样本的可利用价值。样本降解的速度与不少因素（pre-analytical variables） 有关，需要检测的目的生物分子对致降解因素的易感性也各不相同。
因此，严格执行 SOP 与 CPG，在分子诊断中将人为影响和环境因素的作用降到很低，才能很大限度地维持所检分子的完整性，确保胶质瘤分子诊断的准确性。
2.个体化分析：肿瘤细胞组成、需要指出的是病人自身体质和肿瘤血运分布等个体因素可以对单个胶质瘤标本的降解速度的影响不尽相同；因而，在临床操作中，应当对每例病人样本的取材方法、保存运输条件、冷冻时间等诸多分子诊断前数据做个体化分析。
对各例样本进行降解程度评估，用以校正分子诊断结果。对经历放、化疗的病人，做分子诊断时应当考虑放、化疗等因素对所检分子的影响，并区别放化疗因素造成胶质瘤的继发性分子变化。
3. 的精细化的分子诊断：首先，考虑到胶质瘤的异质性，不宜将整块肿瘤组织一同匀浆进行分子分析；而应当对每例待检样本进行病理切片和组织学观察。根据组织形态学特点，必要时应当在显微镜下（石蜡切片）或冰冻切片机上（冰冻切片）对细胞进行选择性收集 （selective tissuedissection）。
4.本版本提出的胶质瘤分子诊断指南是在基因水平（包括 DNA、mRNA 和 miRNA）所做的定性分析，无法获知具有基因分子特征的细胞在所检胶质瘤组织中的比例和分布情况，因此在根据这些基因特征选择治疗方案和预后分析时可能出现偏差。
为了提高胶质瘤分子诊断水准、较终实现精确精准治疗的目的，适时研发并优化以 RNA、蛋白质为标准的定量分子诊断手段，条件允许的时候利用诸如靶向蛋白定量质谱之类的先进技术手段对胶质瘤进行量化的分子诊断，是胶质瘤分子诊断的较终目标与方向。
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