阿柔比星缓释制剂的制备工艺

　　【摘要】  目的 研究以聚乳酸羟基乙酸共聚物为囊材，制备可缓释释药的阿柔比星纳米级微粒制剂。 方法 运用复乳溶剂挥发法，考虑多个条件对制备工艺的影响，将阿柔比星包封在聚乳酸羟基乙酸纳米级微粒中,并采用正交设计对处方进行优化。 结果 制备得到的阿柔比星纳米粒表面光滑，粒径大小均匀，球形致密圆整，具有较高的载药量和包封率，且累计释放率高。 结论 研究微球制备工艺合理,为医药工业上制备阿柔比星聚乳酸羟基乙酸纳米级微粒提供了理论依据。

　　【关键词】  阿柔比星 纳米粒 聚乳酸羟基乙酸 均匀设计

　　阿柔比星是一种新蒽环类抗肿瘤抗生素,化学名为（1R，2R，4S）-2-乙基-1，2，3，4，6，11-六氢-2，5，7-三羟基-6，11-二氢-4-［［2，3，6-三脱氧-4-O-［2，6-二脱氧-4- O-［（2R，6S）-四氢-6-甲基-5-氧-2H-吡喃-2-基］-α-L-来苏-已吡喃糖基］-3-（二甲氨基）-α- L-来苏-已吡喃糖基]氧］-1-并四苯羧酸甲酯。阿柔比星对各种移植性动物肿瘤如L310、P388、Ehlrich腹水癌、Lewis肺癌、S100肉瘤、B16黑色素瘤和CDF8及C3H乳癌等均有较强的抗瘤活性，对卵巢癌和胃癌也有疗效。阿柔比星能抑制癌细胞的生物大分子合成,特别是对RNA合成的抑制作用很强。阿柔比星在应用治疗白血病与各种肿瘤时，需连用10d，间隔2～3周后重复注射，或1周2次，连续应用8周［1～3］。
   
　　聚乳酸羟基乙酸共聚物［Poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA］有良好的生物相容性和生物降解性且降解速度可控,在生物医学工程领域有广泛的用途。目前已被制作为各种组织工程支架材料及药物缓释载体［4,5］。各种PLGA 药物微球在国外也已上市多种，本研究以PLGA作为阿柔比星的载体,制备新型的阿柔比星缓释纳米级微球注射剂，以达到延长半衰期，提高病患依从性。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  电子天平（德国Sartorious）;高速匀浆机（德国IKA）;磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造公司);超速冷冻离心机(Beckmen L8 - 60M);S-520 型扫描电镜(日本Hitachi 公司);粒径检测仪（Beckman Coulter LS）;紫外分光光度仪(上海研菱仪器有限公司);冷冻干燥机(上海浦东冷冻干燥设备有限公司);效果很好液相色谱（德国安捷伦）;混悬振动器（德国IKA）;恒温水浴箱(天津恒奥科技发展有限公司);恒温培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）。试剂：阿柔比星（台州椒江星成医药公司）;PLGA（50/50，美国伯明翰公司);二氯甲烷( Sigma公司);其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

　　1.2  方法

　　1.2.1  阿柔比星聚乳酸羟基乙酸纳米粒制备方法  采用复乳溶剂挥发法制备纳米级微球，将高浓度阿柔比星微酸性水溶液加至溶有PLGA的二氯甲烷溶液中，高速搅拌制成油包水初乳，再将此初乳缓缓注入装有0℃的PVA微碱性水溶液中。在自制的复乳搅拌反应器中，复乳搅拌形成水包油包水复乳。然后以低速搅拌，其间用真空泵向反应器中进气，并伴用抽风机从反应器内向外排气，3h后即得固化的阿柔比星纳米级微球。所得纳米粒用蒸馏水反复冲洗。过筛后的阿柔比星纳米粒再经冷冻干燥得到纳米粒粉末［6,7］。

　　1.2.2  阿柔比星聚乳酸羟基乙酸纳米粒包封率的测定  精密称取阿柔比星聚乳酸羟基乙酸纳米粒适量,以二氯甲烷溶解，萃取阿柔比星后定量，用效果很好液相法测定阿柔比星的含量，折算包封率［8～10］。

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　　1.2.3  阿柔比星聚乳酸羟基乙酸纳米粒的形态学测定  称取30mg阿柔比星聚乳酸羟基乙酸纳米粒进行粒径检测并通过显微镜及电镜进行形态学观察。

　　1.2.4  阿柔比星聚乳酸羟基乙酸纳米粒体外释放的研究  精密称取阿柔比星，用体外释放液溶解，并逐步稀释该阿柔比星溶液后测定浓度，并建立阿柔比星标准曲线。精密称取阿柔比星纳米粒5mg，置于含30ml体外释放液的特制试管中，放置到37℃的恒温摇床中并以90r/min速度振荡,分别于4h、8h、12h、1d、1.5d、2d、3d、4d、6d、8d、10d、15d、20d、30d定时取出10ml上清液 ,同时补充10ml体外释放液。将释放递质在3 000r/min条件下离心3min，取上清液，将下层残余的细小微粒残质放回特制试管中。用效果很好液相法测定上清液中阿柔比星含量，将此含量作为当段时间内的释放量，测定到30d，并计算累积释放百分率［11］。

　　1.2.5  正交设计阿柔比星聚乳酸羟基乙酸纳米粒制备实验  在制备过程中,对一些影响阿柔比星微球的包封率和释放因素进行初筛,选择PLGA浓度、油水相体积比、初乳搅拌速度3个因素作为考察对象,每个因素选择3个水平,按L9(34)正交表设计实验，其中PLGA浓度按15%、20%和25%设计实验，油水体积比按1：10、1：15和1：20设计实验，初乳速度按3 000r/min、4 000r/min和5 000r/min设计实验。

　　2  结果

　　2.1  包封率及体外释放结果  按照L9(34) 正交表进行实验,制备9批微球,各批微球的包封率和30d的累计释放量结果见表1。其中包封率约为60%的微球工艺较适合阿柔比星聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备，具体条件为PLGA浓度按20%，油水体积比1：20，初乳速度4 000r/min。本组实验制备的纳米粒30d累计释放量近90%，其中前10d的累计释放量达70%。

　　表1  9批微球的包封率和30d的累计释放量（略）

　　2.2  形态学结果  经过粒径检测，该组阿柔比星纳米粒的平均粒径为363.3nm见图1。

　　3  讨论
   
　　阿柔比星纳米粒制剂的研究工作于上世纪90年代末期开始，包裹材料围绕聚乳酸和聚乳酸羟基乙酸等高聚物，但至今国内外报道较少。笔者分析原因主要是由于阿柔比星不易用于肌肉注射，而目前医学界研究的高聚物微球制剂多为肌肉注射制剂。按照传统的制备参数去制备阿柔比星缓释制剂，很难制备出符合静脉注射要求的剂型。另外的原因在于纳米粒制备工艺不稳定，小试实验比较难于放大。
   
　　图1  电镜下阿柔比星纳米级微球外观（略）  

　　由于纳米粒制备时，载药量、包封率、体外释放量、粒径等多个指标共同决定纳米粒的质量，所以本实验采用正交设计法。将影响制备工艺的较重要的几个因素考虑进来，忽略掉后期容易改进的工艺参数，针对多个指标综合评价阿柔比星纳米粒制备的优等工艺。在纳米粒的制备中改进了传统实验方法，采用了多种手段，调节纳米粒的制备参数。制备所得阿柔比星纳米粒包封率可达65%，外形均匀圆整，定期累计释放率高。与先前报道的阿柔比星纳米粒制剂相比，本实验所得的纳米级微球制剂在粒径上略大。可能由于复乳搅拌速度不同，或是同运用复乳法时初乳制备方法不同所致。待将不同制备方法制备的阿柔比星制剂进行体内实验，便可判断两种制剂的优缺点。笔者认为虽然粒径较小进入体内将更加安全，不易造成体内诸多细小血管的阻塞，但是粒径过小则易凝集粘连。较终仍需未来体内实验证明以上判断。本纳米粒制剂的累计释放率难达接近满分，分析原因可能是由于粒径小，部分阿柔比星纳米粒在体外释放过程中，伴随实验操作而丢失。
   
　　本实验制备的阿柔比星纳米粒为冻干剂，相比液体阿柔比星纳米粒制剂更加稳定。阿柔比星原型制剂的主要缺点是易造成骨髓抑制、心脏毒性、胃肠不适等毒副作用。当用聚乳酸羟基乙酸包裹后，缓释释放剂型缓慢释放阿柔比星到血液中，由此提高了阿柔比星的药物稳定性，延长了半衰期，降低了毒副作用。本剂型处方经过正交优化，固定实验参数后，反复多次实验。所得纳米粒包封率，纳米粒外观和体外释放曲线基本一致。可以证明本实验制备工艺稳定性高，对于未来工业上制备阿柔比星聚乳酸羟基乙酸纳米级微球具有借鉴意义。

　　【参考文献】

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