PET-CT检查结果评估保肛手术

　　为了确定直肠癌远侧端壁内浸润状况及直观反应直肠癌的远侧端浸润情况，本试验将结合PET/CT成像技术与分子生物学检测方法，对直肠癌远侧端浸润的影像学及分子病理学进行研究，旨在为中低位直肠癌能否保肛提供更为准确的手术前评估。

　　一、材料和方法

　　1、材料

　　肠镜检查及病理证实为直肠中下段腺癌病人45例（已剔除非全直肠系膜切除术），男26例，女19例，年龄28~78（平均51）岁，其中中高分化腺癌28例，低分化腺癌17例；病理分期：DukesA期6例，B期27例，C期12例，肿瘤直径>3 cm 31例，肿瘤直径< 3cm 14例。所有病人肠道准备干净后在PET/CT检查前行肛肠综合治疗仪检查，于肿瘤下缘约0.5 cm及1 cm处横向缝合两针，用深静脉导管剪成0.5~1 cm长的细管，穿入线内结扎，作为标记物。

　　2、方法　　

　　1）显像方法及图像处理18F-FDG PET-CT浑身显像

　　病人检查前禁食6 h以上，注射18FFDG前1 h口服30 mg普鲁本辛以减少肠胃道生理性浓聚，静脉注射18FFDG196444MBq（812 mCi），（南京军区福州总医院PET中心自行生产，放射化学纯度>99%）. 平卧安静休息45~60 min后，行GE Advance Ⅱ PET/CT仪浑身显像，图像通过迭代法重建为横断、冠状断及矢状断层图像，每层厚度为1.25 mm。

　　2）图像分析

　　由2名核医学医师对PET显像图进行读片，采用标准化摄入值（standardized uptake value， SUV）评价病灶内18FFDG浓聚程度，以SUV2.5为鉴别病灶的良恶性的分界值［3］. 以直肠肿瘤远侧端SUV≥2.5定为PET/CT阳性段粘膜；测量两标记线之间的距离，肿瘤中心SUV值及PET显像大小（很大横断面/矢状面及上下缘）及PET局限性浓聚下缘SUV值2.5处位置；观察肿瘤的大小、肿瘤占肠壁的比例、直肠系膜的浸润以及直肠系膜或肠系膜下动脉淋巴腺是否转移情况。

　　3）标本制作及取材开腹按全直肠系膜切除术（total mesorectal excision，TME）

　　手术原则，进行直肠癌TME保肛手术，切除标本解剖直肠系膜，观察肿瘤在肠壁及直肠系膜内的浸润情况。 查出淋巴腺送病理，于肿瘤的对侧纵行切开直肠管壁，轻轻牵拉标本两切端，使肿瘤下缘两标记线的距离与PET/CT上检测的距离一致（自然位置）， 用大头钉固定后，再次测量肿瘤大小及肿瘤下缘与标记线之间距离，肿瘤下缘组织以PET/CT检查SUV为2.5处为界，取相等长度的宽为0.5 cm两段组织，标记为PET阳性段与PET阴性段，各组织分别进行p53及CD34免疫组织化学染色。

　　4）病理及免疫组织化学检查

　　CD34，p53均为鼠抗人单克隆抗体，为Maixin.Bio公司产品（即用型），免疫组化试剂盒用Maixin.Bio公司EliVisionTMplus广普试剂盒. 免疫组织化学染色方法采用PAP法进行染色，p53及CD34表达的阴性对照染色均采用PBS替代第一层抗血清，其余步骤均一致。

　　5）微血管密度（microvessel density，MVD）检测

　　用CD34标记微血管内皮细胞，呈棕黄色，在肿瘤组织中分布于肿瘤及间质组织中，在直肠癌旁组织中分布于粘膜的固有层内，微血管的形态不规则，有的新生血管已呈管腔结构，有的只见内皮细胞呈线状或点状分布。先在低倍视野内（40×， 100×）找至肿瘤组织内微血管密度很高的区域，然后在高倍视野内（200×）光镜，观察每张切片10个粘膜固有层区CD34表达并计数，取其均植作为每例标本的MVD值. 血管内皮细胞被染成棕色，不管有无管腔，凡看至单个孤立内皮细胞或多个内皮细胞紧密排列均计数为1个血管，分辨不清或染色模糊的细胞不计入计数结果。

　　6）p53检测

　　p53蛋白呈棕色颗粒状或团块状分布在粘膜上皮细胞核，200倍光镜观察每张切片10个粘膜固有层区p53阳性表达，半定量评分. 免疫组化阳性半定量评分标准为：
 
　　① 阳性产物显色强度：阴性0分，弱1分，中等2分，强3分；

　　② 阳性产物分布范围：占粘膜固有层总面积75% 4分，显色强度和分布范围的评分相乘，所得分数为该例标本的阳性积分。

　　统计学处理：应用SPSS13.0软件包进行统计分析，计量数据以x±s表示. 组间比较用方差分析，PET阳性与阴性段比较用配对t检验，P0.05）。 即直肠远侧端PET阳性长度与肿瘤的大小、病理类型以及肿瘤分期无关。

　　三、讨论　　

　　虽然腔内B超、CT以及MR在评价肿瘤的大小、浸润范围、以及淋巴腺转移方面有各自的优势，但PET及PET/CT技术具有敏感性高的特点，目前主要应用于直肠癌的手术前分期和手术后的随访，而对手术前肿瘤的分期方面则明显高于CT和MRI，对于直肠癌手术后局部复发的诊断也优于CT和传统的影像诊断。 但是，PET/CT显像用于癌旁组织的显像，目前国内外尚未见到报道。

　　研究显示，结直肠癌早期即存在高血管化和高的血流灌注量，局部缺氧既可以改变产生对葡萄糖的过度利用，也可以促肿瘤的微血管形成，因而MVD的改变可反应出葡萄糖的利用，由于直肠癌远侧组织存在MVD的变化，因而PET显像非常可能可以部分反应出微血管变化，本课题通过分析肿瘤的PET显像与直肠标记物间的关系，发现肿瘤显像的阳性段的远端平面超越肿瘤下缘的标记平面，因而我们推测PET显像的阳性范围除了与肿瘤组织有关外还可能与癌旁组织的显像有关。PET/CT扫描显示的直肠腺癌远侧端的PET阳性平均长度为0.7 cm，此长度与国外报道直肠癌远切端切除长度为1 cm的标准相仿。　　

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　　野生型p53基因突变型可通过抑制肿瘤促血管形成因子的表达，而起到抗肿瘤血管形成的作用，而突变型p53基因可能通过蛋白激酶C增进VEGF的表达，同时其突变也加强了VEGF的转录，增进肿瘤血管生成。 MVD被认为是反映肿瘤血管生成的金标准。本文联合检测p53与CD34表达可更准确地评估直肠癌远侧癌边粘膜的分子生物学的异常，结果显示： 直肠腺癌的远侧端PET阳性段粘膜与PET阴性段粘膜分子病理学表达上存在显著性差别，即PET阳性段粘膜p53及CD34为高表达，PET阳性段粘膜存在分子生物学的异常。

　　本研究结果还表明PET阳性长度与肿瘤的分期、分化以及大小无关，因而我们认为直肠癌远侧端PET/CT显像可作为一独立参数，为确定直肠癌安全切除远切端长度提供依据，并对评估保肛手术具有一定的指导意义。