白血病的生物治疗方法

　　作者：张阳，张连生，曾鹏云，吴重阳，易良才，白俊

　　[摘 要] 目的：研究树突状细胞（dendritic cell，DC）联合同源细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）对急性髓细胞白血病细胞株KG-la中白血病干细胞（leukemic stem cell，LSC）的体外杀伤和诱导凋亡作用。

　　方法：分离健康人外周血单个核细胞，贴壁细胞用GM-CSF和IL-4诱导培养DC，悬浮细胞用IL-2、IL-1、IFN-γ 和CD3 mAb诱导培养CIK。将KG-1a细胞冻融物作为抗原负XDC（即Ag-DC），与CIK共培养作为实验组（Ag-DC-CIK），无抗原负X的DC与CIK共培养作为对照组（DC-CIK），单独CIK作为空白对照组，与KG-1a共育后流式细胞术检测各组细胞中CD34+ CD38- CD123+白血病干细胞的比例。DC-CIK与KG-1a细胞共培养，流式细胞术检测各组细胞中KG-1a细胞与CD34+ CD38- CD123+ 细胞的凋亡率。

　　结果：外周血单个核细胞成功诱导DC。CIK组、DC-CIK组及Ag-DC-CIK组中CD3+ CD56+细胞比例为（17.36±4.44）%、（28.22±3.66）%和（36.16±5.88）%，依次升高（P﹤ 0.05）。与对照组相比，Ag-DC-CIK组与DC-CIK组细胞中CD34+ CD38- CD123+细胞比例显著降低[（8.78±0.62）% vs（3.95±0.57）%、（3.03±0.62）%，P<0.01]。DC-CIK可诱导KG-1a细胞凋亡，凋亡率由（2.34±0.74）%上升至（12.27±1.01）%，但对其中CD34+ CD38- CD123+细胞无明显的诱导凋亡作用。结论：DC联合CIK能杀伤急性髓细胞白血病干细胞，但无明显的诱导凋亡作用。

　　近年随着新药的出现和治疗方法的改进，白血病的完全缓解率和长期无病生存率已有了明显提高，但较高的复发率和多药耐药仍是目前治好白血病的主要障碍。随着对白血病研究的深入及白血病干细胞（leukemic stem cells，LSCs）概念的提出，LSCs被认为是白血病复发的主要根源，清除LSCs才有可能治疗白血病[1-2]。

　　细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced cells，CIK）是一种新型的免疫活性细胞，CD3+ CD56+ T细胞是其主要效应细胞，具有强大的抗瘤活性和非MHC限制性杀瘤的优点[3]。DC与CIK细胞共培养能提高CIK细胞增殖及杀伤活性[4]。课题组前期研究[5-6]发现，DC与CIK细胞共培养对多种肿瘤细胞包括白血病细胞均有明显的杀伤作用，但DC联合CIK（ DC-CIK）对LSCs的杀伤作用少有报道。

　　本研究以CD34+急性髓细胞白血病细胞株KG-1a为模型，观察DC-CIK对LSCs的体外杀伤作用，为LSCs靶向治疗及临床应用DC-CIK清除残存白血病细胞提供实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 

　　rhTNF-α购自美国Peprotech公司，rhIL-4及rh-GM-CSF由厦门特宝生物工程公司惠y，CD3抗体、rhIL-1、rhIL-2及IFN-γ均购自武汉博士德生物工程有限公司，CD80、CD83、CD14、HLA-DR、CD3、CD8、CD56、CD34、CD38抗体均为美国eBioscience公司产品，CD86、CD1a、CD123抗体购自美国BD公司， RPMI1640干粉购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司。Annexin V-FITC试剂盒购自南京凯基生物发展有限公司。

　　1.2 KG-1a细胞冻融抗原的制备 

　　急性髓细胞白血病细胞株KG-1a购自上海拜力生物科技有限公司。收集对数生长期KG-1a细胞，生理盐水洗涤3次后，调整细胞密度为1×107/ml，置液氮中10min，取出迅速放入37℃水浴锅中，重复3次，离心后取KG-1a细胞冻融上清，经0.22μm微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

　　1.3 DC的体外诱导和培养 

　　采集健康志愿者外周血12ml，常规分离外周血单个核细胞，用RPMI1640完全培养基调整细胞密度至2×106/ml，置于5% CO2、37℃培养箱中培养3h，收集贴壁细胞（同时收集悬浮细胞用于培养CIK）。加入适量RPMI1640完全培养基、100ng/ml rhGM-CSF及100ng/ml rhIL-4，隔日半量换液，每日倒置显微镜观察细胞形态变化及生长情况。培养第5天时将DC分为2组：一组加入KG-1a冻融抗原50μl（即Ag-DC），另一组加入RPMI1640完全培养基50μl，第7天两组各加入rhTNF-α50ng/ml。

　　1.4 CIK的体外诱导、培养 

　　取1.3中收集的悬浮细胞，调整细胞密度为1×106个/ml，加入IFN-γ1000U/ml，置于5% CO2、37℃培养箱中培养24h后，加入CD3抗体50ng/ml、rhIL-1700U/ml及rhIL-2700U/ml，每3d换液并补充rhIL-2，诱导、培养CIK，倒置显微镜观察细胞的生长情况。

　　1.5 DC-CIK体外共培养 

　　培养第7天将CIK分为3组：第一组为实验组，按DC:CIK为1:5加入抗原负载的DC（Ag-DC-CIK），第二组为对照组，同上述比例加入无抗原负载的DC（DC-CIK），第三组为空白对照组（CIK），继续培养CIK细胞至2天。

　　1.6 流式细胞术检测DC与CIK的免疫表型 

　　收集培养第8天的DC，调整细胞密度为1×106/ml，取细胞悬液200μl，加入CD80、CD83、CD86、CD1a、CD14及HLA-DR单抗。同法收集培养12d的CIK，加入CD3、CD8、CD56单抗，上机流式检测，检测结果由Cell Quest软件进行分析。

　　1.7 流式细胞术检测CD34+ CD38- CD123+ 细胞比例 

　　收集对数生长期KG-1a细胞，分为4组：第一组空白对照组，第二组加入Ag-DC-CIK，第三组加入DC-CIK，第四组加入CIK，作用48h后收集细胞，调整细胞密度为1×106个/ml，取细胞悬液200μl，加入CD34、CD38及CD123单抗，流式细胞仪检测各组样本中CD34+ CD38- CD123+ 白血病干细胞的比例。

　　1.8 流式细胞术检测KG-1a细胞和白血病干细胞的凋亡 

　　收集对数生长期的KG-1a细胞，分为4组：第一组为KG-1a凋亡检测空白对照组，第二组加入DC-CIK；第三组为LSCs凋亡检测空白对照组，第四组加入DC-CIK。24h后收集细胞，第三、四组中分别加入CD34、CD38及CD123单抗，室温避光孵育20min，PBS洗涤，重悬于结合缓冲液中，加入Annexin V 5μl，室温避光染色15min，流式细胞仪检测KG-1a细胞和LSCs的凋亡率。1.9 统计学处理 数据用 x±s表示，采用SPSS11.0软件包，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。　

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　　2 结 果

　　2.1 DC形态学观察 

　　倒置显微镜下观察，培养天细胞为透亮小圆形，贴壁生长；培养第3天细胞体积较前稍有增大，细胞大部分呈2形，部分细胞见细小的毛刺状突起，出现小的聚集现象；培养第5天细胞体积较前明显增大，大部分细胞可见毛刺状或指状突起（图1），可见大集落样生长，部分细胞呈悬浮生长；培养第7天细胞体积无明显增大，细胞数量较前有所减少，大部分细胞呈不规r形，突起较前多且明显（ 图1）。

图1 培养5d（A）和7d（B）的DC（瑞氏染色，×1 000） 　　Fig.1 DC after cultured for 5d（A）and7d（Wright staining×1 000）

　　2.2 DC免疫表型分析结果 

　　经流式细胞术检测培养第8天DC免疫表型显示，（67.08±4.83）%细胞表达CD1a、（61.24±8.24）%细胞表达CD83，（60.30±8.19）%细胞表达CD80，（75.41±9.21）%细胞表达CD86，（53.77±5.26）%细胞表达HLA-DR，仅（13.09±4.03）%细胞表达CD14。由此可见，外周血单个核细胞在体外经过诱导培养后分化成高纯度的成熟DC。

　　2.3 DC共培养增加了CIK中CD3+ CD8+ 和CD37+ CD56+细胞的比例

　　经流式细胞术检测培养2天各组CIK细胞中CD3+ CD8+、CD3+ CD56+细胞的表达，结果显示，Ag-DC-CIK组分别为（60.49±2.56）%、（76.16±5.88）%，DC-CIK组分别为（53.02±5.18）%、（28.22±3.66）%，空白CIK组分别为（41.98±4.08）%、（17.36±4.44）%。Ag-DC-CIK组、DC-CIK组CD3+ CD8+、CD3+ CD56+细胞比例明显高于CIK组（P<0.01），且Ag-DC-CIK组高于DC-CIK组（P<0.05，表1）。由此可见，与DC共培养的CIK其中效应细胞的比例明显高于未共培养的CIK。

表1 DC共培养增加CIK中CD3+ CD8+、CD3+ CD56+细胞的比例（%） Tab.1 Co-culture with DC increased ratio of CD3+ CD8+ and CD3+ CD56+ cells in CIK（%）

Group	CD3+ CD8+	CD3+ CD56+
CIK	41.98±4.08	17.36±4.44
DC-CIK	53.025±5.18*	28.22±3.66**
Ag-DC-CIK	60.49±2.56**	36.16±5.88**△

l P < 0.05，** P < 0.01 vs CIK group；△ P < 0.05vs DC-CIK group

　　2.4 DC共培养增强CIK对CD34+ CD38- CD123+ 细胞的杀伤效应 

　　流式细胞仪检测结果（表2）表明，单独CIK组、DC-CIK组、Ag-DC-CIK与KG-1a细胞共培养后，各组细胞中CD34+ CD38-CD123+细胞比例均显著低于对照组[（6.59±1.07）%、（3.95±0.53）%、（3.03±0.62）%vs（8.78±0.62）%，P<0.01]，但DC-CIK组与Ag-DC-CIK组相比差异无统计学意义（P>0.05）。由此可见，DC与CIK共培养后对CD34+ CD38- CD123+ 细胞的杀伤效应明显高于未共培养的CIK。

　　表2 DC共培养增强CIK对CD34+ CD38- CD123+ 细胞的杀伤效应（%）

Tab.2 Co-culture with DC increased cytotoxicity of CD34+ CD38- CD123+ cells（%）

Group	CD34+ CD38- CD123+*
Control	8.78±0.62
CIK	6.59±1.07**
DC-CIK	3.95±0.53**△
Ag-DC-CIK	3.03±0.62**△

** P < 0.01 vs control group；△ P < 0.05 vs CIK group

　　2.5 DC-CIK对KG-1a细胞及CD34+ CD38- CD123+ 细胞凋亡的影响 

　　DC-CIK作用于KG-1a后，凋亡细胞由（2.34±0.74）%升至（12.27±1.01）%（P<0.01），说明DC-CIK可诱导KG-1a细胞凋亡。DC-CIK杀伤后CD34+ CD38- CD123+中凋亡细胞仅由（3.47±0.41）%升至（4.04±0.72）%（P>0.05），说明DC-CIK不能诱导白血病干细胞凋亡（图2）。

图2 DC-CIK对KG-1a细胞及CD34+ CD38- CD123+ 细胞凋亡的影响Fig. 2 Effect of DC-CIK on apoptosis of KG-1a and CD34+ CD38- CD123+ cells **P<0.01vs Before killing group

　　

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　　3 讨 论 

　　LSCs较g是由Lapidot和Bonnet提出[7]，人急性髓细胞白血病细胞中有一群CD34+ CD38-的细胞，能够在异体移植模型中连续增殖形成白血病，而CD38+定向祖细胞没有此功能[8]。LSCs与HSC都表达CD34+ CD38-，但LSCS不表达CD117、CD90，而表达CD123[1]。

　　新的的研究表明，CD34+ CD38-不再作为所有白血病患者LSCs特异性的细胞表面标志物[9]。急性髓细胞白血病LSCs对传统的放、化疗均不敏感且存在多药耐药，成为白血病复发耐药的根源[10]。LSCs的靶向治疗已成为近年的研究热点，而白血病的免疫治疗是具有较大发展潜力的抗肿瘤手段，其中CIK被认为是肿瘤过继性细胞免疫治疗的优选细胞，但细胞免疫治疗对LSCs的杀伤与凋亡作用如何少有报道。由于LSCs在体内的数量稀少，很难分离与培养，因此本实验以CD34+急性髓细胞白血病细胞株KG-1a为细胞模型，体外间接研究DC-CIK免疫治疗对LSCS的杀伤与凋亡作用。

　　本实验结果显示，与CIK组相比，DC与CIK共培养后，CD3+CD8+细胞、CD3+CD56+细胞比例显著提高，Ag-DC-CIK组很高，此结果与文献报道一致[11]。对于KG-1a细胞中CD34+ CD38- CD123+细胞的杀伤作用，Ag-DC-CIK、DC-CIK组杀伤活性明显高于CIK组，提示，DC联合CIK杀瘤效应的增强可能由于DC与CIK共培养后增加二者表面分子的表达，上调IL-12、IFN-γ 等细胞因子的分泌，增强CIK的杀伤活性[12-13]。国内已有报道[14]，CIK对G0期CD34+急慢性白血病细胞有明显的杀伤作用，本实验结果表明，DC联合CIK可明显降低KG-1a细胞中CD34+ CD38- CD123+细胞的比例，提示对LSCs的杀伤效应与DC的特异性杀伤和CIK的非特异性杀伤有关。

　　LSCs不仅具有自我更新和无限增殖的潜能，还存在凋亡耐受，通过寻找一些诱导LSCs凋亡的途径有助于清除白血病复发耐药的根源[15-16]。目前国内外前期研究[17-18]发现，CIK对人类白血病细胞有明显的诱导凋亡作用。CIK主要通过Fas-FasL途径诱导细胞凋亡，Verneris等[19]发现，CIK细胞可对抗体内FasL阳性肿瘤细胞所引发的效应细胞活性下降，CIK可上调自身cFLIP、Bel-2、Bel-XL、DAD1及survivin等抗凋亡基因的表达，发挥抗凋亡作用。但CIK细胞是否能诱导LSCs凋亡未见报道。本实验结果显示，DC-CIK能诱导KG-1a细胞凋亡，但对其中的CD34+ CD38- CD123+细胞无明显的诱导凋亡作用，其凋亡率从（3.47±0.41）%升至（4.04±0.72）%（ P>0.05）。

　　其中可能的机制为：CD34+ CD38-细胞表面低表达Fas[20]。有研究[21]表明， CIK细胞及其分泌的细胞因子IFN-γ 能上调部分肿瘤细胞表面Fas的表达，通过Fas-FasL途径诱导肿瘤细胞凋亡。本实验结果提示Fas的上调并不足以诱导CD34+ CD38- CD123+细胞凋亡；同时CIK具备合成FasL的能力，能抵抗肿瘤细胞引发的CIK凋亡。但有研究[22]认为，FasL可提高人骨髓中原始CD34+ CD38-l血祖细胞的存活，抑制细胞凋亡。

　　综上所述，CIK作为目前肿瘤生物治疗较有发展前景的治疗手段之一，与DC共培养后可增加其靶向性和杀伤活性，对LSCs也有明显的杀伤作用，提示DC-CIK联合治疗可提高白血病的治好率，延长白血病患者的生存期。

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