概述生物治疗在肝癌治疗中的研究和应用

　　肝癌的生物治疗

　　作者：徐立友　宋钊　刘钊　战志勇

　　来源：《中国现代普通外科进展》 2009年09期

　　「摘要」  生物治疗作为肿瘤治疗的新概念备受关注，已成为继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第4种模式。随着现代分子生物学技术和基因工程技术的迅速发展，为原发性肝癌的生物治疗开辟了全新的领域，并已取得了越来越多可喜的成果，分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗、内分泌治疗、干细胞治疗等显示出了良好的应用前景。就生物治疗在肝癌治疗中的研究和应用作一概述。

　　「关键词」  肝肿瘤•生物治疗

　　原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PLC）中90%为肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。随着现代分子生物学技术和基因工程技术的迅速发展，为PLC的生物治疗开辟了全新的领域，生物治疗已成为继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第4种模式，并显示出了良好的应用前景。主要包括：分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗、内分泌治疗、干细胞治疗等。

　　1　分子靶向治疗　　　

　　HCC的发病机制十分复杂，其发生、发展和转移与多种基因的突变、细胞信号传导通路和新生血管增生异常等密切相关，其中多个关键性环节，是进行分子靶向治疗的理论基础和重要的潜在靶点。分子靶向药物治疗PLC已成为新的研究热点。靶向治疗是将免疫分子、分子受体或脂质体等载体，与药物、放射性核素或生物毒素等偶联，靶向性杀伤肿瘤细胞。

　　1.1　针对表皮生长因子及其受体的靶向治疗　

　　表皮生长因子（epidernal growth factor，EGF）是生长因子家族的主要成员之一，是含53个氨基酸残基的多肽激素。EGF可以强烈刺激细胞分裂，与胚胎的发生与生长、组织的修复与再生以及肿瘤的发生有密切的关系。EGF及其受体（EGFR）在PLC中存在过表达［1］，与PLC的形成、发生、发展有密切关系［2-4］。抗EGFR药物如埃罗替尼（erlotinib）和西妥昔单抗（cetuximab），能够靶向性作用于肿瘤细胞表面的EGFR，有效阻断由EGFR介导的下游信号传导通路和细胞学效应，并诱导EGFR内化和降解。但近年多项临床研究显示，抗EGFR治疗对PLC患者的疗效并不显著［5］，因而抗EGFR治疗在HCC的治疗上尚存在一定争议。

　　1.2　抗血管生成治疗　

　　肿瘤生长、代谢、浸润转移和复发均与肿瘤的血液供应密切相关。PLC是一种富血管的恶性肿瘤，恶性程度高、生长速度快、转移范围广、复发率高。目前已证实肿瘤患者体内存在多种血管生成因子，其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是体内作用较强的一种血管生成因子［6］。PLC患者VEGF血清水平显著的高于肝脏良性病变患者和正常人群［7］。缺氧是VEGF较强烈的诱导剂［8］，由于肿瘤细胞在不断生长过程中对氧的需要不断增加，而肿瘤周围组织供氧量有限，因此导致肿瘤分泌大量VEGF，不断促使新生血管生成，以满足肿瘤生长的需求。此外，VEGF诱导新生的肿瘤相关血管结构不完善且通透性强，部分肿瘤细胞可以穿过血管壁进入血管向远处转移，故加速了肿瘤浸润和转移［9］。在PLC患者中，己发生转移的患者VEGF血清水平也较未发生转移的患者显著增高［9］。因此，VEGF在PLC的生长、浸润、转移、治疗和提示预后方面都有重要的作用。近年来，抗血管生成治疗在 HCC的治疗中占据了越来越重要的地位。目前临床上应用较广泛的抗血管生成药物包括VEGF抑制剂贝伐单抗（bevacizumab，Avastin）和Brivanib等。贝伐单抗是一种新型的抗VEGF的人源化单克隆抗体，可结合VEGF并防止其与内皮细胞表面的受体（Flt-1和 KDR）结合而发挥作用、减少肿瘤内的血管形成，从而使肿瘤组织无法获得生长、增殖所需的血液、氧及其他养分，较终导致肿瘤坏死。近年来，有学者将贝伐单抗用于不能手术和介入治疗的晚期HCC患者，取得了较好的效果［10］。

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　　1.3　信号传导通路抑制剂治疗　

　　哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian targetof rapamycin，mTOR）是哺乳动物磷脂酰肌醇/蛋白激酶（PI3k/Akt）通路的下游效应物，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，mTOR通过调节其他激酶，如40S核糖体6激酶（S6k），细胞周期依赖蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK） 和真核细胞翻译起始因子（4E结合蛋白，4EB） 的磷酸化，在蛋白质翻译过程中起重要调节作用。虽然与 mTOR有关的信号传导途径尚未完全阐明，一个很明显的事实是mTOR参与了蛋白质合成的调节，并与生长因子及其受体、细胞周期进程及膜运输相互作用［11］。生长因子激活 PI3k和Akt，然后通过mTOR介导大量蛋白激酶S6k、CDK、4EBP磷酸化，影响肿瘤细胞的存活和增殖［12］。VEGF通过介导激酶链 PI3k-Akt-mTOR调控血管内皮细胞的增生、存活和转移［13］。抑制 mTOR的功能可以消除由 PI3K/Akt通路介导的增殖信号，使细胞周期阻滞，抑制肿瘤生长，因此mTOR抑制剂作为一种抗肿瘤药物的作用较近再次引起关注。目前已有西罗莫司（Sirolimus）和依维莫司（Everolimus）2种商品化抗mTOR的药物。

　　1.4　多靶点抑制剂治疗　

　　研究表明，Raf/MAPK-ERK激酶（MEK）和细胞外信号调节激酶（ERK）通路在HCC发病过程中有一定作用［14］。此外，HCC细胞系内过度表达的活化MEK1可通过阻止细胞凋亡而促进肿瘤的生长和存活。HCC是一种富血管性肿瘤，VEGF 可促进 HCC的发展和转移。因此，阻断通过Raf/MAPK-ERK的信号传导及VEGF的作用可能会对HCC起到治疗效果［15］。

　　分子靶向治疗在控制HCC的肿瘤增殖、预防和延缓复发转移以及提高患者的生活质量等方面可能具有独特优势；循证医学高级别证据已充分证明基因治疗药物可以延长晚期HCC患者的生存期，而联合其他治疗药物或方法有可能取得更好的效果。

　　2　免疫治疗　　

　　目前免疫治疗对临床已生长的实体瘤的消除能力尚十分有限，对大量的肿瘤细胞也难以奏效，在临床上多用于手术、介入等方法的辅助治疗，或不能耐受化疗以及不能手术切除的HCC患者。包括主动免疫、非特异性免疫、过继免疫和联合免疫等。

　　2.1　主动免疫治疗　

　　主动免疫治疗是指利用肿瘤细胞的特异性物质诱导患者产生特异性免疫，进而主动杀伤肿瘤细胞的过程，目前用于临床的PLC主动免疫包括HCC肿瘤疫苗、树突状细胞疫苗。

　　2.1.1   HCC肿瘤疫苗　

　　是将自身或异体同种HCC细胞经过物理因素（如照射、高温）、化学因素（如酶解）及生物因素（如病毒感染、 基因转移）等的处理，改变或消除其致瘤性，保留其免疫原性，输入体内，刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫，达到治疗PLC、预防HCC转移和复发的目的［16］。人类肿瘤免疫排斥抗原——黑色素瘤抗原家族（melanoma antigens，MAGEs）的发现，为肿瘤的免疫治疗提供了特异性抗原。由于MAGE抗原能被肿瘤组织特异性表达且可与人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）1和HLA2形成抗原肽/HLA复合物，能被杀伤T细胞（cytotoxio T lymphocyte，CTL）识别和杀伤，提示MAGE抗原用于PLC的免疫治疗，开发肿瘤疫苗有着广阔的前景。

　　2.1.2　树突状细胞疫苗　

　　树突状细胞（dendritic cell，DC）是体内功能较强的专职抗原递呈细胞 （antigen presentinz cell，APC），可以刺激初始T细胞增殖、诱导初始免疫应答，在抗肿瘤细胞免疫应答中发挥重要作用。肿瘤可使DC功能失常，使之处于非成熟状态。只有成熟的DC才能有效呈递抗原，以诱导机体产生有效的抗癌免疫应答［17］。目前用DC疫苗治疗HCC临床应用报道不多，有待进一步研究和探讨。

　　2.2　非特异性免疫治疗　

　　非特异性免疫治疗的目的：肿瘤相关抗原在恶性肿瘤细胞上的表达比正常细胞高得多，并足以使这些抗原成为有效的攻击目标。另外，可通过激发免疫系统的免疫效应、修饰免疫应答等方法，非特异性地增强机体对肿瘤的免疫排斥能力。

　　常用非特异性免疫制剂包括：

　　1）生物制剂，主要是重组的细胞因子，如IL、IFN、TNF等，既可单独使用，也可联合应用；

　　2）微生物及其产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、混合菌苗、溶链菌和高聚金葡素等；

　　3） 胸腺肽；

　　4）中医药。

　　2.3　过继免疫治疗　

　　过继免疫治疗以输注自身或同种特异性或非特异性肿瘤杀伤细胞为主，不仅可纠正细胞免疫功能低下，而且可直接发挥抗肿瘤作用。包括：淋巴因子激活的杀伤细胞、肿瘤浸润的淋巴细胞、细胞毒性T细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞等。

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　　2.3.1　淋巴因子激活的杀伤细胞　

　　淋巴因子激活的杀伤细胞 （lymphokine activated killer cell，LAK cell）是用高浓度 IL-2激活的肿瘤患者自体或正常供者的外周血单个核细胞，LAK细胞在体外有广谱的抗自体及异基因肿瘤的活性，可直接溶解、杀伤瘤细胞［18］。LAK细胞半衰期短，与 IL-2联合应用，可保持LAK细胞的活性，以保证疗效。IL-2/LAK细胞治疗对PLC治疗性切除术后预防复发有较高的价值。

　　2.3.2　肿瘤浸润的淋巴细胞　

　　肿瘤浸润的淋巴细胞 （tumor infiltrating lymphocyte，TIL）为肿瘤组织分离出的淋巴细胞经IL-2培养而产生，为自体肿瘤特异性杀伤细胞。目前认为，TIL 对肿瘤细胞的杀伤活性较LAK细胞高。

　　2.3.3　细胞毒T淋巴细胞　

　　细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）为特异性抗原体外诱导单核细胞克隆。CTL需信号系统（MHC，TCR）和第2信号系统（共刺激分子如 B7）激活，具有肿瘤杀伤特异性。 Haruta 等［19］报道，对晚期PLC患者而言，CTL的治疗效果要优于LAK细胞。

　　2.3.4　细胞因子诱导的杀伤细胞　

　　细胞因子诱导的杀伤细胞 （eytokine-induced killer cell，CIK cell）为 MabCD3（抗 CD3单抗）、IL-1、IFN-γ和 IL-2培养的正常人外周血淋巴细胞。来源于CD3+CD56- T淋巴细胞具有广谱的抗肿瘤活性，在动物实验中有较好的治疗效果［20］。

　　2.4　联合免疫治疗　

　　由于肿瘤生物学特性所具有的特殊免疫逃逸机制，导致单一性免疫治疗难以奏效，因此联合治疗成为目前临床免疫治疗的优选。在化疗过程中提高患者免疫力，对抗化疗药物免疫抑制的副作用，起到协同作用。

　　3　基因治疗　　

　　研究表明，PLC发生有单中心及多中心，且与个体的基因缺陷有关。多基因、多阶段的癌基因或抑癌基因变构为PLC发生、发展的分子基础［21］。PLC的基因治疗是在基因调节水平上进行操作以杀伤或抑制肿瘤细胞的治疗方法。随着DNA 重组技术和转基因方法的不断完善，基因治疗的研究获得了迅猛发展。

　　3.1　抑癌基因治疗　

　　抑癌基因治疗是将具有正常功能的野生型抑癌基因（如 p53、p66等）通过各种途径转染至肿瘤细胞中，重建失活的抑癌基因功能，恢复细胞的正常生长表型，或者诱导细胞凋亡，从而达到控制肿瘤细胞生长的目的。p53基因是目前研究和应用得较多的一个，不仅可抑制癌细胞生长，还可诱导其凋亡；p16基因能阻抑细胞生长，但不诱发凋亡。p53反义核酸或向细胞内导入 wt-p53的基因治疗，可以抑制肿瘤的增殖，诱导凋亡，提高对药物的敏感性［22］。Okimoto等［23］将带有野生型p53基因的腺病毒载体Adomv p53通过肝动脉注入小鼠RCN-9结肠癌细胞肝转移模型，48 h后，经腹腔注射顺铂（CDDP），发现转移的PLC细胞广泛凋亡而肝脏功能并未受损。

　　3.2　自杀基因治疗　

　　自杀基因疗法又被称为“病毒介导的酶/前体药物治疗（virus-directed enzyme/prodrug therapy，VDEPT）。原理是把某些病毒、细菌中特有的转换酶基因——自杀基因导入体内后，利用其产生的酶将无毒或低毒的药物前体转成细胞毒性代谢产物，从而杀死肿瘤细胞的基因治疗方法。目前，用于PLC基因治疗的自杀基因系统有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV2TK）基因/无环鸟苷（GVC）系统、胞嘧啶脱氨酶（CD）基因/5-氟胞嘧啶（5-FC）系统和嘌呤核苷酸磷酸酶（PNP）基因/氟达拉滨系统等。Harada等［24］以EB病毒基因组成的质粒载体与非病毒载体PAAD结合成杂交载体介导HSV-TK/GCV系统，能有效治疗实验小鼠PLC。

　　3.3　免疫基因治疗　

　　免疫基因治疗通过基因重组技术增强机体的抗肿瘤免疫功能而达到治疗肿瘤的目的。免疫基因治疗可分为2类: 一种是将细胞因子基因导入PLC细胞，通过增强肿瘤细胞表面肿瘤抗原性、MHC 分子或黏附分子的表达而提高免疫原性；另一种是将细胞因子基因导入免疫活性细胞，如LAK细胞和树突状细胞等，通过直接刺激免疫效应细胞而达到增强免疫反应、抑制肿瘤生长的目的。目前，常用的细胞因子有IL-2、IL-12、IL-18、TNFα、IFN和集落刺激因子等。IL-12是作用较显著的细胞因子之一。Harada等［25］研究发现以IL-12基因治疗免疫抑制状态下的鼠PLC模型，可明显增加肿瘤细胞周围淋巴细胞的浸润并增强肿瘤特异性杀伤细胞的反应；IL-12可显著抑制肿瘤的复发。其他免疫基因治疗还包括IL-12和IL-2联合转染、IL-12和TNF、GM2CSF和IL-2 联合应用等。

　　3.4　反义基因治疗　

　　PLC的发生、发展过程中许多癌基因及生长因子的基因产物大量表达，运用反义技术可以抑制这些产物的过度表达，从而抑制肿瘤的生长。根据PLC发病原因，导入反义寡核苷酸封闭PLC基因的表达或用正常抑癌基因取代突变抑癌基因。已报道设计针对VEGF、端粒末端转移酶、c-myc等癌基因的表达途径，诱导PLC细胞凋亡抑制其生长［26］。反义技术的主要缺点是目的基因的靶向性欠佳和半衰期较短，目前一般作为手术和化疗的辅助治疗方法。

　　3.5　联合基因疗法　

　　PLC的发生涉及到多基因参与，因此单用一种基因治疗效果有限。不同的基因治疗策略联合应用可相互协同，增强抗肿瘤效果常采用免疫基因和自杀基因的联合治疗。Drozdz等［27］联合HSV-TK和IL-12治疗效果都明显优于单个基因治疗。

　　尽管目前有多种细胞因子、抑癌基因等可用于肿瘤的基因治疗，但总体来讲，效果尚不理想，因而寻找更多更具杀伤力的基因将大大推动基因治疗的研究和应用范围。基因治疗尚存在诸多理论上和技术上的问题，如靶向性、基因载体的转移效率、导入基因的持续表达、基因治疗的安全性等问题，还有待进一步完善［28］。

　　4　内分泌治疗　　

　　在PLC患者中有33%的病例可查出雌激素受体，使用抗雌激素的三苯氧胺治疗PLC已有报道。有学者认为，大剂量口服三苯氧胺可作为逆转多药耐药基因的药物。然而，较近几次大样本的RCT和Meta分析却未发现有统计学意义［29］。

　　5　干细胞治疗　　

　　干细胞移植现已成为恶性血液病、实体瘤等疾病的治疗性方法之一。近年来，已有多个学者研究报道了造血干细胞参与了肝组织的再生和修复过程。它是利用血液成分分离装置处理血液，采取存在于末梢血中的造血干细胞进行移植的手段。由于PLC化疗敏感性较低，以现有水平，行造血干细胞、骨髓移植有一定困难。

　　6　结语　　

　　总之，经过多年的研究，生物治疗技术已取得了越来越多可喜的成果，并显示出了广阔的应用前景。生物治疗技术在PLC的综合治疗中将发挥越来越重要的作用。我们有理由相信不久的将来，HCC的生物治疗会逐渐过渡成为一种常规的治疗方法，为PLC患者带来福音。

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