PacBio第三代测序技术迎来创新性升级，准确度可与二代测序相媲美
来源：医生在线
时间：2019/12/18 13:41
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以PacBio、Oxford Nanopore为代表的第三代测序技术因测序读长较长，对于基因组中复杂区域尤其是复杂结构变异的研究具有得天独厚的优势，因此，该技术近些年备受科学界的青睐。然而，相较二代测序技术，三代测序的“高错误率问题”一直是阻碍其发展的主要问题之一。
前不久，作为三代测序技术的代表，牛津纳米孔（Oxford Nanopore）测序技术取得了突破性的进展，其新型R10芯片的发布使准确率大幅提升。点击链接，查看此前报道
现在，PacBio公司的第三代测序技术也迎来了重大升级，实现了能够与二代测序相媲美的准确度，相关成果发布在国际顶 级期刊Nature Biotechnology。这是PacBio对改进高准确度、长读长测序方法的又一次进步。
Wenger博士解释道：“关键在于我们对CCS测序方法进行了技术创新，也就是“预扩展”（pre-extension）。”
CCS测序过程中，相互独立的聚合酶会不断结合核苷酸，直到失去活性。在这一过程中，聚合酶通常由于DNA受损等原因脱落，因此，PacBio测序系统受制于样本DNA质量。为解决这一问题，研究团队通过筛选未损坏的DNA分子，较 大限度地减少测序系统中受损DNA数量。在DNA样本加载到测序仪之前就开始进行测序反应，经过几个小时的延伸，如果聚合酶还可以继续“工作”，研究人员就可以判断DNA没有受损，并选择性的将DNA加载到测序仪，进行长读长测序。
此外，研究人员利用SageELF仪器确保选择的DNA分子大小相同，并确定预扩展的较 佳持续时间。这一创新性的设计是整个测序过程得以顺利实施的关键，有助于聚合酶在测序仪中长时间“工作”。
同时，研究团队发现，新CCS测序方法检测微小变异和结构变异的能力与短读长测序相当，甚至超过了短读长测序。几乎所有（99.64％）变体都可以被分类为单倍型，从而进一步改善变异检测。值得关注的是，单独使用CCS的reads进行从头基因组组装可以产生连续且准确的基因组，其contigN50超过15Mb，一致性为99.997％，基本优于已有长读长测序方法。同时，据研究人员估计，利用该测序方法可以纠正GIAB参考序列中的2,434个基因测序错误。此外，新方法有助于产生更加完整的基因组，以及分析所有基因区域的序列，包括短读长技术的低映射区域，且成本与当前的短读长测序相似。
是否还需要“polishing”？
polishing通常指将PacBio的长reads与Illumina的短reads相结合，将短reads覆盖在长reads上以对其进行polishing，或矫正错误位点。对此，Wenger博士做出了回应：“PacBio的新测序方法不需要polishing。这些reads的原始平均准确度为99.8％，与短reads的准确度相似。”
作为二代测序技术的强劲对手，第三代测序技术在近期所取得的一系列突破性进展，必将再次推动其在生命科学研究以及精 准医学等领域的普及应用！
前不久，作为三代测序技术的代表，牛津纳米孔（Oxford Nanopore）测序技术取得了突破性的进展，其新型R10芯片的发布使准确率大幅提升。点击链接，查看此前报道
现在，PacBio公司的第三代测序技术也迎来了重大升级，实现了能够与二代测序相媲美的准确度，相关成果发布在国际顶 级期刊Nature Biotechnology。这是PacBio对改进高准确度、长读长测序方法的又一次进步。
PacBio所采用的circular consensusse quencing（CCS）测序技术工作原理是在线性DNA分子的两端连接发夹接头（hairpinadapters），以创建一个“SMRTbell”模板。与接头结合的聚合酶可从接头移动，插入DNA链，并添加碱基、读取序列。CCS通过在接头多次移动产生高保真度（HiFi）reads，一直持续到聚合酶失活，产生同一DNA分子的多个pass。该平台在保证准确度的前提下，reads读取范围是1000~2000碱基。在较 新文章中，研究团队利用升级的CCS方法生成了超过10,000个碱基的reads。
Wenger博士解释道：“关键在于我们对CCS测序方法进行了技术创新，也就是“预扩展”（pre-extension）。”
CCS测序过程中，相互独立的聚合酶会不断结合核苷酸，直到失去活性。在这一过程中，聚合酶通常由于DNA受损等原因脱落，因此，PacBio测序系统受制于样本DNA质量。为解决这一问题，研究团队通过筛选未损坏的DNA分子，较 大限度地减少测序系统中受损DNA数量。在DNA样本加载到测序仪之前就开始进行测序反应，经过几个小时的延伸，如果聚合酶还可以继续“工作”，研究人员就可以判断DNA没有受损，并选择性的将DNA加载到测序仪，进行长读长测序。
此外，研究人员利用SageELF仪器确保选择的DNA分子大小相同，并确定预扩展的较 佳持续时间。这一创新性的设计是整个测序过程得以顺利实施的关键，有助于聚合酶在测序仪中长时间“工作”。
对于升级前的PacBio技术来说，其reads通常具有较高的错误率。但这些错误往往是随机的，如果对同一区域进行多次测序，平均误差就会被降低。在较 新研究中，研究团队证明，通过多次读取相同的DNA分子（平均10次）可以产生高质量的测序数据。同时，新的CCS测序方法产生的reads与Illumina的reads错误率大致相同，但比Illumina的reads长得多。
同时，研究团队发现，新CCS测序方法检测微小变异和结构变异的能力与短读长测序相当，甚至超过了短读长测序。几乎所有（99.64％）变体都可以被分类为单倍型，从而进一步改善变异检测。值得关注的是，单独使用CCS的reads进行从头基因组组装可以产生连续且准确的基因组，其contigN50超过15Mb，一致性为99.997％，基本优于已有长读长测序方法。同时，据研究人员估计，利用该测序方法可以纠正GIAB参考序列中的2,434个基因测序错误。此外，新方法有助于产生更加完整的基因组，以及分析所有基因区域的序列，包括短读长技术的低映射区域，且成本与当前的短读长测序相似。
是否还需要“polishing”？
polishing通常指将PacBio的长reads与Illumina的短reads相结合，将短reads覆盖在长reads上以对其进行polishing，或矫正错误位点。对此，Wenger博士做出了回应：“PacBio的新测序方法不需要polishing。这些reads的原始平均准确度为99.8％，与短reads的准确度相似。”
作为二代测序技术的强劲对手，第三代测序技术在近期所取得的一系列突破性进展，必将再次推动其在生命科学研究以及精 准医学等领域的普及应用！
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