非小细胞肺癌微转移研究

　　非小细胞肺癌（NSCLC）是临床常见恶性肿瘤，目前治疗效果仍不理想，局部复发及远处转移是治疗失败主要原因。常规方法无法检测到的微转移可能与预后相关。近年来应用免疫组化和分子生物学方法检测外周血、骨髓和区域淋巴结微转移，并对其临床意义进行研究。本文就非小细胞肺癌微转移的检测方法、标记物选择及临床意义的研究现状作一简要综述。　　 

　　Review of detection and clinical significance of micrometastases in non-small cell lung cancer　　
　　GU Ke  reviewing，  ZHANG Jun-ning  checking

　　Department of Radiotherapy， the First Affiliated Hospital of Soochow University， Soochow， Jiangsu， China　　
　　Abstract: Non-small cell lung cancer （NSCLC） has a poor prognosis due to local relapses and metastases. Recently，micrometastases are supposed to be relevant to the prognosis and immunocytochemistry as well as molecular biology methods are adopted to identify the detection and clinical significance of micrometastases in peripheral blood， bone marrow or lymph nodes of the patients with NSCLC。

　　Keywords: Non-small cell lung cancer；  Micrometastases　　

　　近几年非小细胞肺癌（NSCLC）的疗效有所提高，但仍难令人满意。远处转移及局部复发是治疗失败的较主要原因。Mountain[1]的研究结果表明，一旦出现远处转移，5年生存率仅为1.7%。及早、准确地发现肿瘤转移显得十分重要。肿瘤转移包括传统意义上的转移和微转移（micrometastases）。CT，MRI，B超等一般只能发现>1g或>1cm的病灶，而HE（hematoxylin and eosin）染色常规病理检查其淋巴结微转移漏诊率高达10%-30%[2]。微转移的检测对肿瘤治疗选择及预后指导具有重要意义。

　　微转移，或称隐匿转移（occult metastasis），是指通过常规手段检测不到的，存在于淋巴结，骨髓，胸膜腔，循环血液和其他组织器官中的微小转移，可能是肿瘤复发和转移的根源。以往对乳腺癌和消化道肿瘤微转移的研究较多，目前NSCLC中微转移受到更多关注。　　

　　1、检测NSCLC微转移的标记物　　

　　目前尚无理想的NSCLC专一性标记物，需联合多种标记物进行检测[3]。目前用于检测的标记物主要有二大类，包括（组织特异性）蛋白和基因两个水平。组织特异性蛋白以CK应用较广，此外还有上皮特异性抗原（epithelial specific antigen，EPA）、组织多肽抗原（tissue polypeptide antigen，TPA）等。

　　组织特异性基因有：CKmRNA，CEA，MUC1，LUNX（Lung-specific gene），肺泡表面蛋白（surfactant protein， SP），另外还有P53， nm23-H1， Ki-67， P21等。

　　1.1  CKs（cytokeratin）

　　即细胞角蛋白，存在于各胚叶向上皮细胞分化的细胞浆内，分子量在40-68Kda范围内，是细胞骨架系统中间丝组成成分之一，广泛存在于上皮组织细胞中，在间叶组织（如血液，骨髓，淋巴结等）中缺乏表达，作为标记物具有稳定性好，有高抗原性等优点，已成为上皮细胞和上皮性肿瘤细胞较为敏感和特异的标记物。CKs根据其相对分子质量和等电点不同至少可分为20种不同亚型。CK6、7、14、15、16、17在正常支气管上皮细胞中弱表达，CK5、8、18、19在正常肺上皮细胞中强表达。上皮源性肿瘤如鳞癌、腺癌大多数为CK（+），肺腺癌和鳞癌中，CK5、6、8、14、16、18、19强表达[4]。

　　其中CK19特异性较高，较常用，研究表明它在间叶组织中无表达，而在乳腺癌、胃肠癌、肺癌等上皮性肿瘤组织中稳定表达[5]。

　　1.2  LUNX（lung-specific X protein）   

　　是Iwao等[6]通过mRNA差异显示技术新近分离的一个人类肺组织特异性基因。定位于20p11.1～q12，全长1015bp，包含一个开放的读码框，编码含256个氨基酸、分子量为26.7Kda的蛋白质。 Iwao等试验表明，LUNX在间叶组织中不表达，在所有正常肺组织及NSCLC组织中特异表达，而在其他人类肿瘤和正常组织中不表达或极少表达，具有很高敏感性和特异性。

　　1.3  MUC1（粘蛋白基因1）   

　　是一种上皮组织特异性标记物，编码上皮组织细胞膜上黏蛋白的核心蛋白，定位于染色体Iq21～24。在正常支气管、肺组织和NSCLC瘤组织中均有表达，而在正常情况下淋巴组织中无表达。MUC1mRNA大多应用在淋巴结微转移研究中[7]，诊断灵敏度86.7%，特异度接近满分。

　　2、NSCLC微转移灶检测方法

　　2.1 免疫组化（immunocytochemistry，IHC）法  

　　也称作免疫细胞化学技术（immunocytochemical techniques，ICC）， 是指显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对相应抗原进行定性定量及定位的测定。

　　可分两种方法：APAAP法（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法，其灵敏度较高）和ABC法（亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法，该技术较成熟，但有假阳性可能）。IHC法检测敏感性可达10-5～10-6。IHC法检测NSCLC微转移的标记物有：CK，TPA， EPA等，近年多用CK系列， 但是正常的网状组织中同样存在CK的表达，因而有假阳性可能. IHC法检测CKs常用于研究淋巴结中的微转移[8]。

　　2.2  逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction，RT-PCR） 

　　近几年RT-PCR方法受到重视，广泛应用于各种实体恶性肿瘤微转移检测，亦是目前检测NSCLC微转移较常用技术 。

　　RT-PCR原理：是一种酶促扩增反应，以某种特异mRNA为分子标记，先反转录合成cDNA，然后再进行多周期扩增，可以从基因组DNA中大量制备所需DNA片断，使敏感性大大提高。相对于PCR而言，RT-PCR的优点在于阳性结果可以明确肿瘤细胞的存在[9]， 可检测骨髓、外周血、淋巴结、痰、尿和其他样本中存在的一个肿瘤细胞，敏感度约为10-5～10-7。近来出现的巢式PCR（nested-PCR）进一步改善了原有技术的不足，敏感性达10-6～10-7，但易受污染而出现假阳性[10]。

　　Datta等[11]报道巢式PCR技术检测CK19mRNA假阳性率为3.4%-3.8%。

　　Noguchi及Ruud等人综合分析认为[12，13]，RT-PCR技术假阳性的原因有：外源基因污染、RNA的非法转录、假基因干扰以及引物设计不合理；假阴性的原因有：基因表达产物变异、内源性或外源性RNA酶降解标记物mRNA、待检mRNA结构不完全以及引物设计不合理、实验条件未优化。

　　2.3 流式细胞（flow cytometry， FCM）技术   可以定量测量肿瘤细胞数是FCM的优点。

　　2.4 其他不常用的方法  如肿瘤细胞培养（culture techniques）、绿色荧光蛋白（GFP）标记和显色技术。

　　下一页：NSCLC微转移检测临床意义

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　　3、NSCLC微转移检测临床意义

　　肿瘤微转移检测是分子诊断和分子分期的重要依据，其临床意义主要表现在判断预后，指导治疗及肿瘤监控等方面。对较早期NSCLC术前术中检测外周血、胸膜腔灌洗液[14]及骨髓微转移灶，或术后对淋巴结阴性患者进一步检测淋巴结微转移，发现检测阳性的患者其预后相当于Ⅲ期或Ⅳ期，对这些患者应加强术后辅助治疗。

　　3.1  外周血微转移

　　目前一般通过CK19检测NSCLC外周血微转移，但是其特异性仍存在争议。CK20在NSCLC中表达过低，已明确不是一个好的指标。此外一些新的标记物，如LUNX等也越来越多地应用于检测。许多研究显示存在于血液循环中的肿瘤细胞（circulating tumor cells， CTCs）很可能是术后肿瘤全身转移的根源。Nakanishi等人[15]认为可以通过检测外周血中肿瘤细胞来判断化疗疗效。国内外有多位学者用RT-PCR等技术研究外周血微转移，多数认为NSCLC患者外周血中肿瘤细胞与远处转移有一定关系，进而与其准确分期及预后相关。

　　目前对外周血微转移确切临床意义的争论焦点在于，外周血中的肿瘤细胞是否可以被机体免疫系统所清除。外周血微转移检测的临床地位经更大宗更深入的研究将进一步明确。

　　3.2  骨髓微转移

　　骨髓独特的解剖结构和血流血供使其成为肿瘤细胞可能较早到达并聚集成灶的组织。有人指出，其实骨髓中相当一部分肿瘤细胞是没有增殖活性的，骨髓是一个保存库，这些肿瘤细胞可能再随血液流经全身，到达适宜生长的环境才增殖并形成转移灶。骨髓微转移是一项临床上相对独立的预后因素，还是仅仅为发生远处转移的一个“中转站”，其确切的临床意义是目前国内外学者探讨的热点之一。

　　1980年，Sloane等[16]第一次报道了用IHC法检测乳腺癌患者骨髓中的散在肿瘤细胞。

　　1996年，Pantel等[17]应用IHC技术对NSCLC患者骨髓中CK表达进行检测，发现PN0患者中CK阳性率为54.3%（38/70），研究认为骨髓微转移往往提示有早期复发可能，尤其是血源性转移。

　　2001年，Mattioli等[18]应用IHC和FCM方法对比研究了18例NSCLC和3例食管癌患者的髂骨及肋骨骨髓肿瘤细胞的检测，认为如果骨髓中的肿瘤细胞确实有临床意义，选用手术切除的肋骨作为评价标本要优于髂骨骨髓组织。Mattioli等还认为骨髓微转移是一个独立的预后因素。

　　Rosell等[19]认为，对于NSCLC，尤其是病灶可以完全切除者，若有骨髓及外周血等处肿瘤微转移，应行早期化疗特别是新辅助化疗。相反地，Hsu等[20]应用IHC法检测各期NSCLC患者骨髓CK表达，认为骨髓微转移更可能是NSCLC的一个“附带现象（an epiphenomenona）”，而非真正的转移，并不是一个判断复发和预后的可靠指标。目前大量相关研究愈来愈倾向于认为NSCLC骨髓微转移，特别是持续反复出现的骨髓微转移检测阳性是预后不佳的一项独立指标。

　　3.3  局部淋巴结微转移

　　Salerno等[7]应用RT-PCR检测NSCLC患者MUC1，在10例患者中8例阳性，并且发现淋巴结有微转移患者预后较差。

　　Passlick等[21]的研究成果显示，淋巴结检出微转移的患者其肿瘤复发率比无微转移者高4.3倍。国内王洲等人[22]应用RT-PCR技术检测了50例术后常规病理检查阴性的、Ⅰa期NSCLC患者纵隔淋巴结中MUC1基因mRNA的表达，发现16例患者的20枚纵隔淋巴结中有MUC1基因mRNA表达，据此诊断为纵隔隐匿性淋巴结转移。在其后一年的随访时间内发现7例患者转移，多数为远隔转移（6/7），其早期转移的可能性约为无纵隔隐匿性淋巴结转移者的7倍（OR=7.27），故建议对分期较早的NSCLC应该行清扫淋巴结的微转移检测，对阳性者应予术后辅助治疗。

　　陈乾坤等[23]用IHC法CK染色检测NSCLC患者术后常规病理学检查为阴性淋巴结中的微转移灶，并比较N0期、N1-2期淋巴结有、无微转移灶患者的预后，得出结论：淋巴结有微转移灶的N0、N1期患者的预后与N2期相当，这与Izbicki等人[24]的研究结果相同，建议进一步修订现有NSCLC的TNM分期系统。

　　同时，Nicholson等[25]指出，一些经淋巴结转移的肿瘤细胞可以被机体免疫系统清除，并且淋巴结内的肿瘤细胞在机体免疫监视下有时可以多年保持静止状态，所以在判定淋巴结微转移对预后的影响时要考虑到以上两点。

　　国内外学者对NSCLC淋巴结微转移发生的相关因素亦作了研究。Sakao等[26]报道，肺癌淋巴结微转移与年龄、性别、吸烟史、原发灶大小、病理类型及分化程度无明显相关性；与肿瘤发生部位呈一定相关性，中央型发生淋巴结微转移的可能性要高于周围型。

　　Passlick等人也认为中央型NSCLC淋巴结微转移的发生率明显高于周围型，而且低分化肺癌也明显高于中高分化肺癌。

　　而牛中喜等[27]用巢式RT-PCR对31例NSCLC的119枚淋巴结中的CK19mRNA、MUC1mRNA表达进行研究，认为肺癌淋巴结微转移率与组织学类型、细胞分化程度和p-TNM分期有密切关系；而与原发灶大小、部位、性别、年龄及吸烟史无明显关系。

　　下一页：存在的问题及展望

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　　4、存在的问题及展望

　　目前在NSCLC微转移研究中存在的问题主要有：

　　（1）尚无公认的理想的肺癌专一性微转移检测标记物；

　　（2）肿瘤微转移检测现今仍缺乏标准的检测方法；

　　（3）部分学者对外周血、骨髓、淋巴结中微转移的确切临床意义仍有争议，争议焦点在于微小转移能否被机体免疫系统清除或受免疫监视而长期静止；

　　（4）此外，对微转移阳性患者如何综合治疗也还没有一致意见。较近，许多学者倾向于寻找新的标记物或联合两种以上标记物，并且联合应用几种检测方法来检测NSCLC微转移，在一定程度上提高了研究的科学性和准确性。总的来说，越来越多的学者对NSCLC微转移的临床意义持肯定态度，随着更广泛更深入的研究工作开展，对NSCLC微转移的研究将会有更清晰的定论。（顾科综述，张军宁审校）

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